Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.
1. Preparação de materiais
NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
- Prepare o meio 1, o meio de centrifugação 2 e as soluções de armazenamento e trabalho de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glicose fluorescente (2-NBDG ou FD-glicose) de acordo com a Tabela 1 em um gabinete de biossegurança Classe II. Proteja a FD-glicose da luz durante todo o experimento, desligando todas as luzes sob o capô.
- Use reagentes de cultura de células prontos para uso: tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e meio Eagle modificado de Dulbecco sem glicose e sem vermelho de fenol (doravante, DMEM sem glicose).
2. Medição ex vivo da depleção extracelular de FD-glicose em órgãos
- Pré-trate os camundongos com compostos que estimulam o metabolismo da glicose antes da dissecção do órgão, da seguinte forma.
- Use camundongos machos Lepob de nove semanas de idade (n = 11). Alimente todos os ratos com uma dieta regular de ração antes do experimento.
- Atribua os camundongos aleatoriamente em três grupos para injeções intraperitoneais (i.p.).
- Injete camundongos do grupo controle Lepob com 0,1 mL de PBS estéril (n = 4).
- Injetar camundongos do grupo de insulina Lepob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 12 UI de insulina humana por grama de peso corporal (PC) (n = 3).
- Injete camundongos do grupo AAC2 Lepob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 0,1 nmol AAC2 por grama de peso corporal (BW) (n = 4).
- Após 15 min, submeter camundongos à inalação de isoflurano a 5% e exsanguinar sangue por punção cardíaca dos animais anestesiados.
- Dissecar o tecido adiposo branco epididimal visceral (200 mg), fígado (200 mg) e todo o cérebro de cada animal. Use uma capa de biossegurança Classe II para manuseio de tecidos.
- Prepare a solução de trabalho de FD-glicose (0.29 mM) em DMEM sem glicose em um gabinete de biossegurança Classe II sem luz.
- Meça a fluorescência da solução de trabalho de FD-glicose (0,29 mM) nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, usando um leitor de microplacas.
- Incube os tecidos/órgãos colhidos em uma placa de 6 poços contendo PBS por 1 min. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado.
- Após 1 min, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver o PBS. Transfira tecidos/órgãos para uma placa separada de 6 poços contendo 4.000 μL de DMEM livre de glicose e incube por 2 min.
- Após 2 min, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de 6 poços contendo 0,29 mM de solução de trabalho de FD-glicose (1 mL / poço). Incubar as placas de 6 poços contendo tecidos em solução de trabalho de FD-glicose a 37 °C (5% CO2 e 95% de umidade).
- Colete 100 μL de solução de trabalho de glicose FD de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min de incubação, para analisar a cinética da depleção de glicose FD extracelular. Agite antes e depois da coleta.
- Transfira 100 μL de solução de trabalho de glicose-FD para placas de 96 poços para medir a fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, usando um leitor de microplacas.
- Normalize a fluorescência para o valor de 0 min (100%) para cada órgão em cada animal (Figura 1).
Tabela 1: Preparação de meios de cultura e soluções de FD-glicose.
| Solução/Meio | Componentes |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | Etanol (200 μL) e DMSO (200 μL) em tubo de 1-1,5 mL; use etanol de grau de cultura celular e DMSO |
| Médio 1 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e soro de bezerro (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Meio de centrifugação 2 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e Soro Bovino (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Solução de glicose-FD de armazenamento 5 mg/mL (14,5 mM) | Glicose FD (1 mg) e etanol: DMSO (1:1/v/v) (200 μL) em tubo de 0,5 mL; armazenar a -80 °C, preferencialmente sob atmosfera de argônio ou nitrogênio |
| Solução de FD-glicose de trabalho 5 μg/mL (14,5 mM) | Solução de glicose FD de armazenamento 5 mg / mL (1 μL), DMEM livre de glicose (999 μL); prepare imediatamente antes do experimento. |
