Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local
1. Medindo a contração (exemplo SMCs)
- Prepare uma matriz ECIS 96w10e (consulte a Figura 1A para obter uma imagem representativa da matriz com eletrodos ampliados e células semeadas nos eletrodos).
NOTA: Execute as etapas a seguir sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos estéril.
- Cubra uma matriz 96w10e estéril com 200 μL de L-cisteína 10 mM por poço por 30 min à temperatura ambiente.
- Lave a placa duas vezes com água estéril. Deixe a placa secar durante a noite na capa de cultura de tecidos com a tampa ligeiramente aberta.
NOTA: O revestimento da placa com L-cisteína só é necessário ao usar a placa pela primeira vez.
- No dia seguinte, esterilize por UV a placa e a tampa por 30 min. Vire a tampa para cima para que o interior seja esterilizado. Depois que a placa estiver esterilizada, não abra a placa fora da coifa.
- Propagação de células na matriz ECIS
- Pré-aqueça a solução de gelatina estéril a 1% em banho-maria por 30 min.
NOTA: A solução é armazenada na geladeira e pode solidificar, dificultando a pipeta.
- Em seguida, revestir os alvéolos com 100 μl da solução de gelatina a 1 % por alvéolo e incubar a placa a 37 °C durante, pelo menos, 1 h.
- Aspire a gelatina dos poços.
- Conte as células usando um contador de células automatizado e semeie os SMCs em triplicado a uma densidade de semeadura de 30.000 células/poço em 200 μL de meio SMC.
- Coloque a placa com os SMCs no suporte de 96 poços ECIS na incubadora de cultura de células. Clique duas vezes no software ECIS Applied Biophysics para abrir o programa e pressione o botão Setup.
- Verifique se todos os eletrodos têm contato com o suporte (verde; vermelho se não houver conexão) no painel inferior esquerdo rotulado Configuração do poço. Se os eletrodos não estiverem conectados corretamente, ajuste a placa no suporte antes de iniciar a medição.
- Selecione o tipo de placa (matriz de 96 poços) no mesmo painel clicando em Tipo de matriz.
- No painel superior direito Configuração de coleta de dados, clique em frequência única e altere o valor da impedância para 4000 Hz e o intervalo para 8 s.
- Clique no botão Iniciar para iniciar as medições. Aguarde a abertura de um novo painel, onde o arquivo ECIS pode ser salvo.
- Permita que as células se fixem e estabeleçam uma monocamada por 48 h.
NOTA: A fixação e o espalhamento das células nos eletrodos geram um valor de resistência basal (Figura 1B).
- Estimulação de células para induzir a contração
- Induza a contração do SMC estimulando as células com 10 μg/mL do ionóforo de cálcio, ionomicina.
NOTA: A ionomicina induzirá o influxo de Ca2+ extracelular, ativando a cascata contrátil; consulte a Figura 2A para imagens representativas de células contraídas não estimuladas e estimuladas.
- Diluir 1 mg de ionomicina em pó em 100 μL de dimetilsulfóxido para fazer uma solução de estoque de 10 mg / mL e armazenar alíquotas de 10 μL a -20 ° C. Antes de usar, dilua a solução de ionomicina 1:10 no meio SMC para preparar a solução de trabalho a ser adicionada às células.
- Realize a estimulação celular enquanto a matriz ainda está no suporte da matriz dentro da incubadora de cultura de células e os eletrodos estão conectados ao sistema.
- Para estimular as células, retire a tampa e coloque-a sobre uma superfície estéril dentro da incubadora. Preparar duas pipetas, reguladas para 2 μL e 150 μL.
- Antes de iniciar a estimulação, pressione Marcar no software e coloque um comentário.
NOTA: Isso tornará mais fácil encontrar o momento exato da estimulação ao analisar os dados.
- Pipetar 2 μL da solução de trabalho de ionomicina em cada poço o mais rapidamente possível. Uma vez estimuladas todas as células, misturar o meio nos poços com a segunda pipeta.
NOTA: Devido aos efeitos rápidos, não é necessário trocar as pontas entre diferentes linhagens celulares e condições. Trabalhe rapidamente enquanto estimula e mistura porque a ionomicina tem um efeito agudo. Ao estimular um prato cheio, estimule no máximo 3 colunas de uma só vez. Após cada estimulação, aguarde pelo menos 30 minutos até a próxima estimulação para permitir que as células se recuperem da mudança de temperatura e CO2 causada pela abertura da porta da incubadora.
- Logo após a estimulação ser feita, pressione Marcar novamente para adicionar um comentário de que a estimulação foi feita.
- Terminando o experimento de estimulação
- Registre os valores de impedância por aproximadamente 5 min após a estimulação com ionomicina. Termine a gravação pressionando Concluir.
