O ensaio de filamento de actina deslizante: um ensaio de motilidade in vitro para estudar a translocação de filamentos de actina em miosinas imobilizadas

Resumo

Fonte: Tripathi, A., et al. Adaptações específicas de miosina de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, realizamos um ensaio de motilidade in vitro para analisar as interações actina-miosina. O movimento deslizante dos filamentos de actina nas moléculas de miosina imobilizadas é visualizado usando microscopia de fluorescência.

Protocolo

1. Ensaio de filamento de actina deslizante

1. Preparação de lamínula
   1. Faça uma solução de nitrocelulose a 1% em acetato de amila.
   2. Obter uma placa de cultura de tecidos (150 x 25 mm) e adicionar um papel de filtro circular (125 mm de diâmetro) ao fundo da placa.
   3. Coloque oito lamínulas quadradas de 22 mm de espessura nº 1,5 em uma prateleira e lave com aproximadamente 2-5 mL de etanol à prova de 200 seguido de 2-5 mL de água destilada (dH₂O). Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque completamente as lamínulas usando uma linha de ar filtrado ou uma linha N₂.
   4. Pegue uma lamínula e pipete lentamente 10 μL da solução de nitrocelulose a 1% ao longo de uma borda da tira. Em seguida, em um movimento suave, espalhe-o pelo restante da lamínula usando a lateral de uma ponta de pipeta de 200 μL de lado liso. Colocar esta lamínula na placa de cultura de tecidos com a nitrocelulose virada para cima. Repita para as lamínulas restantes e deixe-as secar enquanto prepara os reagentes restantes, e use lamínulas dentro de 24 h após o revestimento.
2. Preparação da câmara
   1. Limpe uma lâmina de microscópio com um papel de lente óptica para limpar detritos grandes. Corte dois pedaços de fita dupla-face, com aproximadamente 2 cm de comprimento.
   2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa da lâmina do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita esteja alinhada com a borda do slide. Coloque o segundo pedaço de fita cerca de 2 mm abaixo do primeiro pedaço de fita de forma que os dois fiquem paralelos e alinhados. Isso cria uma câmara de fluxo que pode conter aproximadamente 10 μL de solução (veja a Figura 1).
   3. Pegue uma das lamínulas revestidas de nitrocelulose da Parte 1. Cole cuidadosamente a lamínula na fita de forma que o lado revestido com nitrocelulose entre em contato direto com a fita (consulte a Figura 1). Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente a interface slide-fita para garantir que a lamínula tenha aderido corretamente à lâmina. Corte o excesso de fita pendurada na borda do slide com uma lâmina de barbear.
3. Preparação de actina
   1. Produza 20 μM de F-actina polimerizando actina globular (G-actina) em tampão de polimerização (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) a 4 ° C durante a noite.
   2. Diluir a F-actina a 5 μM em tampão de motilidade (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Rotular com pelo menos 1,2x excesso molar de rodamina-faloidina. Deixe (coberto com papel alumínio) por pelo menos 2 h no gelo. Isso pode ser usado por até 1-2 meses e armazenado no gelo.
4. Realização do ensaio de filamento de actina deslizante de miosina 5a
   NOTA: Nesta seção, os detalhes do ensaio deslizante de miosina 5a (HMM) são fornecidos.
   1. Prepare as soluções para a miosina 5a descritas na Tabela 1 e mantenha-as no gelo.
   2. Fluxo em 10 μL da miosina 5a (50-100 nM) através da câmara de fluxo e aguarde 1 min.
   3. Fluxo em 10 μL de 1 mg / mL BSA em 50 mM MB com 1 mM DTT (tampão "baixo teor de sal"). Repita esta lavagem mais duas vezes e aguarde 1 minuto após a terceira lavagem. Use o canto de um lenço de papel ou papel de filtro para absorver a solução através do canal, colocando suavemente o canto do papel na saída da câmara de fluxo.
   4. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de TDT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   5. Fluxo em 10 μL da solução de actina negra (5 μM de F-actina, 1 μM de calmodulina e 1 mM de ATP em 50 mM MB com 1 mM de DTT) para eliminar "cabeças mortas".
      1. Pipete a solução com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 27 G para cortar os filamentos de actina antes de introduzir a solução na câmara. Repita esta etapa mais duas vezes e aguarde 1 minuto após a terceira vez. Aproximadamente 20 eventos de pipetagem são suficientes.
      2. Para realizar o spin de "cabeça morta", adicione uma quantidade estequiométrica de F-actina à miosina na presença de 1 mM de ATP e 1 mM de MgCl₂ a uma concentração de sal de 500 mM. Em seguida, ultracentrifugue a 480.000 x g por 15 min a 4 °C. A miosina morta estará no pellet.
   6. Fluxo em 50 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP para esgotar a câmara de filamentos de actina livres.
   7. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de TDT. Repita esta lavagem mais duas vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP.
   8. Fluxo em 10 μL de solução de actina rodamina 20 nM (Rh-Actina) contendo 1 mM de DTT em 50 mM MB e aguarde 1 min para permitir a ligação rigorosa dos filamentos de actina à miosina 5a presa à superfície da lamínula.
   9. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de DTT para lavar os filamentos de Rh-Actina não ligados à superfície. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   10. Fluxo em 30 μL de tampão final.
   11. Registre imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nm para visualizar a Rh-Actina. Um tempo de exposição apropriado é de 200 ms a 1,4 mW de potência do laser para uma duração total de aquisição de 0,5-1 min.
       NOTA: Certifique-se de que a taxa de aquisição seja dimensionada adequadamente para a velocidade dos filamentos em movimento. Uma consideração importante antes de coletar dados para uso com programas de rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. Movimentos de subpixel entre quadros resultarão em uma superestimação da velocidade, e movimentos de várias centenas de nanômetros são necessários para obter valores precisos. Uma taxa de aquisição ideal apresenta o deslizamento da actina por pelo menos uma distância de um pixel entre os quadros. No caso do microscópio TIRF usado para a imagem aqui, esse limite se traduz em 130 nm; Portanto, uma miosina que deve viajar 1 μm/s deve ser fotografada a uma taxa de 5 quadros/s (intervalo de 0,2 s) para atingir 200 nm de movimento, enquanto uma miosina que deve viajar 10 nm/s requer 0,05 quadros/s (intervalos de 20 s). Os dados podem, portanto, ser reduzidos nesta fase, se necessário.

Tabela 1: Tampões usados no ensaio de deslizamento

Nome do buffer	Composição (M5a)	Composição (NM2b)	Etapa(s) usada(s) (M5a/NM2b)	Comentários
4X Buffer de Motilidade (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Aspire e armazene em 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	EGTA de 0,4 mM	EGTA de 0,4 mM
	pH 7,4	pH 7,4
50 mM Tampão de motilidade salina (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Aspire e armazene em 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Aumente o volume com dH2O	Aumente o volume com dH2O
500 mM Tampão de motilidade salina (500 mM MB)	N/A	25% v/v 4X MB		Aspire e armazene em 4°C
		500 mM NaCl
		Aumente o volume com dH2O
Miosina	0,05-0,1 μM de miosina	0,2 μM de miosina	4.2	Mantenha no gelo.
	1 mM TDT	1 mM TDT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 500 mM MB
1 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA)	1 mg/mL de BSA	1 mg/mL de BSA	4.3	Mantenha no gelo.
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 500 mM MB
	1 mM TDT	1 mM TDT
5 μM F-actina não marcada em 50 mM MB (actina preta)	5 μM de F-actina não marcada	5 μM de F-actina não marcada	4.5	Mantenha no gelo. Cisalhe a actina pipetando para cima e para baixo 5 a 10 vezes ou usando uma seringa.
	1 μM de calmodulina (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM CaCl2
	Diluir em 50 mM MB	1 μM CaM
		1–10 nM de miosina quinase de cadeia leve (MLCK)
		Diluir em 50 mM MB
MB com 1 mM de TDT e 1 mM de ATP	1 mM TDT	1 mM TDT	4.6	Mantenha no gelo.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
MB com TDT	1 mM TDT	1 mM TDT	4.4, 4.7, 4.9	Mantenha no gelo.
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
20 nM Rodamina-Faloidina F-actina (Rh-Actina)	20 nM Rodamina-faloidina F-actina	20 nM Rodamina-faloidina F-actina	4.8	Mantenha no gelo. Não vórtice.
	1 mM TDT	1 mM TDT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
Buffer final	50 mM KCl	0,7% de metilcelulose (opcional)	4.10	Adicione a glicose, a glicose oxidase e a catalase imediatamente antes de realizar o experimento. Mantenha no gelo.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM TDT	1 mM ATP
	1 μM calmodulina	50 mM TDT
	2,5 mg/ml de glicose	1–10 nM MLCK
	100 μg/mL de glicose oxidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/mL catalase	1 μM calmodulina
		2,5 mg/ml de glicose
		100 μg/mL de glicose oxidase
		40 μg/mL catalase

Resultados

Figura 1: Preparação de câmaras de células de fluxo funcionalizadas. (A) Comece com uma lâmina de microscópio limpa, dois pedaços de fita dupla face cortadas em aproximadamente 2 cm e uma lamínula funcionalizada. (B) Adicione a fita ao centro da lâmina do microscópio. (C) Prenda a lamínula à fita com o revestimento (ou seja, nitrocelulose) voltado pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetato de amila	Indústrias de Pesquisa Ladd	Rolamento 10825
ATP	Millipore Sigma	Rolamento A7699
Albumina de soro bovino	Millipore Sigma	Rolamento 5470
Calmodulina		PMID: 2985564
catalase	Millipore Sigma	C40
Papel de Filtro Circular - Ensaio Deslizante	Millipore Sigma	WHA1001125
Porta-lamínulas	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Lamínulas: Ensaio de filamento de ação deslizante	VWR Internacional	Rolamento 48366-227
DL-Ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Fita dupla face	Depósito de Escritório	909955
EGTA	Millipore Sigma	E4378
etanol	Fischer Scientific	Resposta 4094
G-actina		PMID: 4254541	O estoque de G-actina pode ser armazenado a 200 μM em N2 líquido.
glicose	Millipore Sigma	G8270
Glicose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Kcl	Fischer Scientific	Pág. 217-500
Pontas de pipeta de orifício grande	Fischer Scientific	02-707-134
Metilcelulose	Millipore Sigma	M0512
Lâminas de microscópio	Fischer Scientific	12-553-10
Mops	Fischer Scientific	BP308-100
nitrocelulose	Indústrias de Pesquisa Ladd	10800
Lâminas	Depósito de Escritório	397492
Rodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	O estoque pode ser diluído em metanol 100% até uma concentração final de 200 μM.
Placa de cultura de tecidos - Ensaio deslizante	Corning	353025	Cada placa de cultura de tecidos pode conter aproximadamente nove lamínulas.
Ponteiras de pipeta de 200 μL de lado liso	Thomas Científico	1158U38
equipamento
centrifuga	ThermoFisher Scientific	75006590
microscópio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti com sistema H-TIRF com objetiva TIRF 100x (N.A. 1.49)
Câmera de microscópio	Andor	Modelo: câmera iXon DU888 EMCCD (formato de sensor 1024 x 1024)
Caixa de controle ambiental do microscópio	HIT de Tokai	Thermobox personalizado
Unidade de laser de microscópio	Nikon	LU-n4 quatro unidades de laser com lasers de estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm
Ultracentrífuga de mesa Optima Max-Xp	Beckman Coulter	393315