Ensaio de Motilidade Invertida: Uma Técnica In Vitro para Visualizar o Movimento da Miosina em Filamentos de Actina Imobilizados

Resumo

Fonte: Tripathi, A., et al. Adaptações específicas de miosina de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, realizamos um ensaio de motilidade in vitro para analisar as interações actina-miosina. O movimento deslizante dos filamentos de actina nas moléculas de miosina imobilizadas é visualizado usando microscopia de fluorescência.

Protocolo

1. Purificação de proteínas

1. Lise celular e extração de proteínas
   1. Prepare um tampão de extração de 1,5x com base na Tabela 1. Filtrar e conservar a 4 °C.
   2. Comece a descongelar os pellets de células no gelo. Enquanto os pellets estão descongelando, suplemente 100 mL de tampão de extração com 1,2 mM de ditiotreitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptina, 0,5 μM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e dois comprimidos inibidores de protease. Mantenha no gelo.
   3. Assim que o pellet tiver descongelado, adicione 1 mL do tampão de extração suplementado por 10 mL de cultura de células. Por exemplo, se os pellets de células foram formados a partir de 500 mL de cultura de células, adicione 50 mL de tampão de extração suplementado ao pellet.
   4. Sonicar os pellets de células enquanto os mantém no gelo. Para cada pellet, use as seguintes condições: 5 s ON, 5 s OFF, duração de 5 min, potência 4-5.
   5. Recolher todo o lisado homogeneizado num copo e adicionar ATP (solução-mãe 0,1 M; pH 7,0) de modo a que a concentração final de ATP seja de 1 mM. Mexa por 15 min em uma câmara fria. O ATP dissocia a miosina ativa da actina, permitindo que ela seja separada na etapa de centrifugação seguinte. É, portanto, essencial prosseguir para a próxima etapa imediatamente para minimizar a possibilidade de depleção de ATP e religação à actina.
   6. Centrifugar os lisados a 48.000 x g durante 1 h a 4 °C. Enquanto isso ocorre, comece a lavar 1-5 mL de uma pasta de 50% de resina de afinidade Anti-FLAG (para um pellet formado a partir de 1 L de células) com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, para 5 mL de resina, lave 10 mL de uma pasta a 50%. Na etapa final de lavagem, ressuspenda a resina com 1-5 mL de PBS com volume suficiente para criar uma pasta de 50%.
   7. Após a centrifugação do lisado, combine o sobrenadante com a pasta de resina lavada e agite suavemente na câmara fria por 1-4 h. Enquanto espera, faça os buffers descritos na Tabela 1 e mantenha-os no gelo.
2. Preparação de purificação por afinidade FLAG
   1. Centrifugue a solução na etapa 1.7 a 500 x g por 5 min a 4 °C. A resina será embalada no fundo do tubo. Sem perturbar a resina, remova o sobrenadante.
   2. Ressuspenda a resina em 50 mL de tampão A conforme detalhado na Tabela 1 e centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Sem perturbar a resina, remova o sobrenadante.
   3. Ressuspenda a resina em 50 mL de tampão B conforme detalhado na Tabela 1 e centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Repita esta etapa mais uma vez e ressuspenda a resina em 20 mL de tampão B. Em seguida, misture bem a resina e o tampão invertendo suavemente o tubo com a mão aproximadamente 10 vezes.
3. Eluição e concentração de proteínas
   1. Faça 30 mL de tampão de eluição conforme descrito na Tabela 1 e deixe esfriar no gelo.
   2. Configure a coluna de eluição em uma câmara fria. Despeje suavemente a pasta de resina na coluna. Lave a coluna com 1-2 volumes de coluna de Buffer B conforme os pacotes de resina na parte inferior, garantindo que a resina não seque.
   3. Flua 1 mL do tampão de eluição através da resina e colete o fluxo em um tubo de 1,5 mL. Repita de forma que 12, frações de 1 mL sejam coletadas.
   4. Neste ponto, execute um teste de Bradford bruto nas frações para determinar qualitativamente quais frações são as mais concentradas. Em uma fileira de uma placa de 96 poços, pipete 60 μL 1x reagente Bradford. À medida que as frações são coletadas, misture 20 μL de cada fração por poço. Uma coloração azul mais escura indica as frações mais concentradas.
   5. Em um tubo de 50 mL, colete a proteína restante pipetando suavemente o tampão de eluição restante através da coluna, para liberar qualquer miosina restante ligada à resina no fluxo da coluna. Esse fluxo será concentrado na próxima etapa. Certifique-se de que a resina seja regenerada para reutilização e armazenada de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Agrupe as três frações mais concentradas e concentre ainda mais o fluxo no tubo de 50 mL, bem como nas frações restantes de 1 mL, usando um tubo de concentração de 100.000 MWCO. Carregue a amostra agrupada no tubo de concentração e centrifugue a 750 x g por 15 min a 4 ° C e repita até que toda a proteína eluída tenha sido concentrada em um volume final de aproximadamente 0,5-1 mL.
      nota: Esse tamanho de poro permite a retenção das moléculas de miosina, que têm massas várias vezes maiores que o limite de peso molecular. As cadeias leves permanecem fortemente ligadas aos domínios motores durante esse curso de concentração, conforme verificado pela realização de eletroforese em gel SDS-PAGE no produto final.
4. Diálise e congelamento rápido
   1. Faça 2 L de tampão de diálise, conforme descrito na Tabela 1. Carregue a amostra em uma bolsa ou câmara de diálise e dialise durante a noite na câmara fria.
      nota: No caso de M5a-HMM, após a diálise noturna, a proteína será suficientemente pura para uso em ensaios subsequentes. Outras etapas de purificação, como filtração em gel ou cromatografia de troca iônica, podem ser realizadas, se necessário.
5. Recuperando a miosina após a diálise
   1. Para M5a-HMM, colete cuidadosamente toda a amostra da câmara de diálise e centrifugue a 4 °C por 15 min a 49.000 x g, caso haja agregados indesejados. Pegue o sobrenadante.
6. Determinação da concentração e congelamento rápido
   1. Para determinar a concentração do produto, medir a absorvância utilizando um espectrofotómetro nos comprimentos de onda 260, 280, 290 e 320 nm. Calcule a concentração em mg/ml (c_mg/ml) com a Equação 1, em que A₂₈₀ representa a absorção a 280 nm e A₃₂₀ representa a absorção a 320 nm. A concentração resultante em mg/mL pode ser convertida em μM de moléculas de miosina com a Equação 2, onde M é o peso molecular de toda a proteína (incluindo as cadeias pesadas, cadeias leves, fluoróforos e todas as tags).
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM moléculas = 1000c_mg/mL/M (2)
      nota: Se uma diluição for necessária, ela deve ser feita em um tampão de alta força iônica. O coeficiente de extinção (ε) pode ser determinado importando a sequência de aminoácidos da proteína para um programa como o ExPASy. O rendimento típico para o M5a-HMM é de aproximadamente 0,5-1 mL de 1-5 mg / mL de proteína. O coeficiente de extinção para o M5a-HMM usado neste trabalho foi de 0,671.
   2. Armazene a miosina purificada de uma das duas maneiras. Alíquota entre 10-20 μL em um tubo de parede fina, como um tubo de reação em cadeia de polimerização, e solte o tubo em um recipiente de nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. Como alternativa, pipete diretamente entre 20-25 μL de miosina em nitrogênio líquido e armazene as esferas congeladas de proteína em tubos criogênicos estéreis. Em ambos os casos, os tubos resultantes podem ser armazenados a -80 °C ou nitrogênio líquido para uso futuro.
      nota: Como o ensaio de motilidade descrito abaixo requer quantidades muito pequenas de proteína, o armazenamento em pequenas alíquotas, conforme descrito, é econômico.

2. Ensaio TIRF de molécula única

1. Preparação de lamínula
   1. Divida o pó de estoque em alíquotas de 10 mg (em tubos de 1,5 mL) de metoxi-peg-silano (mPEG) e alíquotas de 10 mg de biotina-Peg-silano (bPEG). Conservar a -20 °C num recipiente selado e sem humidade e utilizar no prazo de 6 meses.
   2. Coloque oito lamínulas quadradas de 22 mm de espessura nº 1.5H (alta precisão) em um rack e lave com 2-5 mL de etanol à prova de 200 seguido de 2-5 mL de água destilada. Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque completamente as lamínulas com uma linha de ar ou N₂ e limpe com plasma com argônio por 3 min.
   3. Coloque as lamínulas limpas em papel de filtro (90 mm) em uma placa de cultura de tecidos (100 x 20 mm) e incube em um forno a 70 °C enquanto executa as seguintes etapas.
      NOTA: A limpeza de plasma pode ser substituída por outros métodos de limpeza química.
   4. Preparar a solução de etanol a 80% com dH₂O e ajustar o pH para 2,0 utilizando HCl. Adicionar 1 ml a uma alíquota de 10 mg de mPEG e 1 ml a uma alíquota de 10 mg de bPEG. Vórtice para dissolver, o que não deve levar mais de 30 s.
   5. Pegue 100 μL da solução de bPEG e adicione 900 μL de etanol a 80% (pH 2,0). Esta solução é 1 mg/mL de bPEG. Em seguida, faça uma solução de ambos os PEGs da seguinte maneira, misturando bem.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentração final: 2 mg/mL).
      2. 10 μL de 1 mg/mL bPEG (concentração final: 10 μg/mL).
      3. 790 μL da solução de etanol a 80% (pH 2,0).
   6. Retire as lamínulas do forno. Dispense cuidadosamente 100 μL da solução de PEG no centro de cada lamínula, certificando-se de que apenas a superfície superior esteja molhada. Em seguida, coloque as tiras de volta no forno e incube por 20 a 30 min.
   7. Quando as lamínulas começarem a ficar furadas, com pequenos círculos aparentes na superfície, retire-as do forno.
   8. Lave cada lamínula com etanol 100%, seque com uma linha de ar e leve ao forno. Incube apenas pelo tempo necessário para criar câmaras na etapa 2.
2. Preparação da câmara
   1. Limpe uma lâmina de microscópio para uso na fabricação da câmara. Corte dois pedaços de fita dupla-face, com aproximadamente 2 cm de comprimento.
   2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa da lâmina do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita esteja alinhada com a borda do slide. Coloque o segundo pedaço de fita cerca de 2 mm abaixo do primeiro pedaço de fita de forma que os dois fiquem paralelos e alinhados.
   3. Pegue uma das lamínulas funcionalizadas do forno (criadas em 2.1). Cole cuidadosamente a lamínula na fita de forma que o lado revestido com PEG fique voltado para baixo e faça contato direto com a fita, conforme mostrado na Figura 1. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente a interface slide-fita para garantir que a lamínula tenha aderido corretamente à lâmina.
   4. Corte o excesso de fita pendurada sobre o slide com uma lâmina de barbear. Essas câmaras podem ser usadas imediatamente ou colocadas em pares em um tubo de 50 mL e armazenadas em um freezer a -80 ° C para uso futuro. É importante armazenar imediatamente ou a superfície se degradará.
3. Realizando o ensaio de microscopia TIRF de miosina 5a
   1. Prepare as soluções para o ensaio de motilidade invertida da miosina 5a descrito na Tabela 2 e mantenha-as no gelo.
   2. Lave a câmara com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT.
   3. Fluxo em 10 μL de 1 mg/mL BSA em 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes e aguarde 1 minuto após a terceira lavagem. Use o canto de um lenço de papel ou papel de filtro para absorver a solução através do canal.
   4. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de TDT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   5. Fluxo em 10 μL da solução de NeutrAvidina em 50 mM MB com 1 mM DTT e aguarde 1 min.
   6. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de TDT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   7. Fluxo em 10 μL de actina rodamina biotinilada (bRh-Actina) contendo 1 mM de DTT em 50 mM MB e aguarde 1 min. Para esta etapa, use uma ponta de pipeta de furo grande e evite pipetar para cima e para baixo para minimizar o cisalhamento dos filamentos de actina fluorescentes para garantir que os filamentos de actina longos possam ser fixados à superfície (20-30 μm ou mais). Uma alternativa eficaz é cortar o cone de uma ponteira de pipeta padrão (com uma abertura de ≈1-1,5 mm).
   8. Lavar com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM de TDT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   9. Fluxo em 30 μL de tampão final com 10 nM de miosina 5a adicionada e, em seguida, carregue imediatamente no microscópio TIRF e registre depois de encontrar o foco ideal para a modalidade de imagem TIRF. Tempos de exposição entre 100-200 ms são apropriados com potência de laser de 1,4 mW para a miosina marcada com actina e GFP. Um tempo de aquisição apropriado para análise de velocidade é de 3 min.

Tabela 1: Tampões usados na purificação de proteínas.

Nome do buffer	composição	Etapa(s) usada(s)	Comentários
M5a Buffer de extração	0,3 M NaCl	1.1	Mantenha no gelo.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Buffer A	0,5 M NaCl	2.2	Mantenha no gelo.
	MOPS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM TDT
	5 mM MgCl2
Buffer B	0,5 M NaCl	2.3	Mantenha no gelo.
	MOPS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM TDT
Tampão de eluição	0,5 M NaCl	3.1	Mantenha no gelo.
	0,5 mg/mL de peptídeo FLAG
	MOPS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7,2
M5a Tampão de diálise	500 mM KCl	4.1	Use cold dH2O para aumentar o volume.
	10 mM MgCl2
	MOPS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM TDT

Tabela 2: Tampões usados no ensaio TIRF.

Nome do buffer	composição	Etapa(s) usada(s)	Comentários
4X Buffer de Motilidade (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2		Aspire e armazene em 4°C
	20 mM MgCl2
	EGTA de 0,4 mM
	pH 7,4
50 mM de buffer de motilidade de sal (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		Aspire e armazene em 4°C
	50 mM KCl
	Aumente o volume com dH2O
Tampão de motilidade de sal de 150 mM (150 mM MB)			Filtre a vácuo e armazene em 4°C
miosina		Veja a receita do "Buffer Final"	Mantenha no gelo.
2 mg/mL NeutrAvidina	2 mg/ml de NeutrAvidina	3.5	Mantenha no gelo.
	1 mM TDT
	Diluir em 50 mM MB
1 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA)	1 mg/mL de BSA	3.3	Mantenha no gelo.
	1 mM TDT
	Diluir em 50 mM MB
200 nM rodamina-faloidina biotinilada F-actina (bRh-Actina)	200 nM rodamina-faloidina biotinilada F-actina	3.7	Evite cisalhar não vorting ou pipetar para cima e para baixo. Para misturar, inverta suavemente.
	1 mM TDT
	Diluir em 50 mM MB
MB com TDT	50 mM TDT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Mantenha no gelo.
	Diluir em 50 mM MB
Buffer final	50 mM KCl	3.9	Adicione a glicose, a glicose oxidase e a catalase imediatamente antes de realizar o experimento. Mantenha no gelo.
	20 mM MOPS, pH 7,2
	5 mM MgCl2
	0,1 mM EGTA
	1 mM ATP
	50 mM TDT
	1 μM calmodulina
	2,5 mg/ml de glicose
	100 μg/mL de glicose oxidase
	40 μg/mL catalase
	10 nM de miosina

Resultados

Figura 1: Preparação de câmaras de células de fluxo funcionalizadas.(A) Comece com uma lâmina de microscópio limpa, dois pedaços de fita dupla face cortadas em aproximadamente 2 cm e uma lamínula funcionalizada. (B) Adicione a fita ao centro da lâmina do microscópio. (C) Prenda a lamínula à fita com o revestimento voltado para baixo e pressione suave...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução 2 M MgCl2	VWR	10128-298
Solução de NaCl 5 M	KD Médico	RGE-3270
ácido acético	ThermoFisher Scientific	984303
Gel de afinidade anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	Rolamento A7699
G-actina biotinilada	Citoesqueleto, Inc.	AB07
Albumina de soro bovino	Millipore Sigma	Rolamento 5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Concentrado de reagentes Bradford	Bio-Rad	5000006
Calmodulina		PMID: 2985564
catalase	Millipore Sigma	C40
Linha celular (Sf9) em SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Papel de Filtro Circular - Ensaio Invertido	Millipore Sigma	WHA1001090
Comprimidos Inibidores de Protease Completos e Sem EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Este deve ser conservado a 4 °C. Os comprimidos podem ser usados diretamente ou podem ser reconstituídos como uma solução estoque 25x, dissolvendo 1 comprimido em 2 mL de água destilada. A solução resultante pode ser conservada a 4 °C durante 1-2 semanas ou pelo menos 12 semanas a -20 °C.
Tubos de concentração (100.000 MWCO)	Corporação EMD Millipore	UFC910024	O MWCO do tubo não é necessariamente "tamanho único", desde que o MWCO seja menor que o peso molecular total da proteína que está sendo purificada. O M5a foi concentrado com um tubo de 30.000 MWCO.
Corante Coomassie Azul Brilhante R-250	ThermoFisher Scientific	20278
Porta-lamínulas	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Lamínulas: Ensaio de Motilidade Invertida	Azer Científico	ES0107052
Tubulação de diálise (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	O diâmetro do tubo de diálise pode variar, mas o MWCO deve ser o mesmo. Os tubos podem ser armazenados em solução de álcool a 20% a 4 °C.
DL-Ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Fita dupla face	Depósito de Escritório	909955
Peptídeo DYKDDDDK	GenScript	RP10586	Isso pode ser dissolvido em um tampão contendo 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 3 mM de NaN3 e 10 mM de MOPS (pH 7,2) até uma concentração final de 50 mg / mL. Isso pode ser armazenado a -20 °C como alíquotas de 300 μL.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Coluna de eluição	Bio-Rad	761-1550	Estes podem ser reutilizados. Para limpar, enxágue a coluna com 2-3 volumes de PBS e água destilada. Refrigerar a coluna a 4° C antes de usar.
etanol	Fischer Scientific	Resposta 4094
glicose	Millipore Sigma	G8270
Glicose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Solução tampão de glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Santa Cruz Biotecnologia	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Scientific	Pág. 217-500
Pontas de pipeta de orifício grande	Fischer Scientific	02-707-134
Inibidor de Leuceptina Protease	ThermoFisher Scientific	Nº 78435
Escada Padrão Mark12 Não Manchada	ThermoFisher Scientific	LC5677
metanol	Millipore Sigma	MX0482
Lâminas de microscópio	Fischer Scientific	12-553-10
Mops	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silano	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidina	ThermoFisher Scientific	31050
NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15 poços	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
Buffer de exemplo do NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientific	Rolamento NP0007
Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	Nº 78830	O PMSF pode ser feito como uma solução estoque 0,1 M em isopropanol e armazenado a 4 °C. A adição de isopropanol resulta em precipitação de cristais, que pode ser dissolvida agitando à temperatura ambiente. Imediatamente antes do uso, o PMSF pode ser adicionado gota a gota a uma solução de agitação rápida até uma concentração final de 0,1 mM.
Lâminas	Depósito de Escritório	397492
Rodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	O estoque pode ser diluído em metanol 100% até uma concentração final de 200 μM.
Mídia SF9	ThermoFisher Scientific	Rolamento 12658-027	Este deve ser armazenado a 4° C. Seu prazo de validade é de 18 meses a partir da data de fabricação.
Placa de cultura de tecidos - ensaio invertido	Corning	353003	Cada placa de cultura de tecidos pode conter aproximadamente quatro lamínulas.
Ponteiras de pipeta de 200 μL de lado liso	Thomas Científico	1158U38
equipamento
centrifuga	ThermoFisher Scientific	75006590
microscópio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti com sistema H-TIRF com objetiva TIRF 100x (N.A. 1.49)
Câmera de microscópio	Andor	Modelo: câmera iXon DU888 EMCCD (formato de sensor 1024 x 1024)
Caixa de controle ambiental do microscópio	HIT de Tokai	Thermobox personalizado
Unidade de laser de microscópio	Nikon	LU-n4 quatro unidades de laser com lasers de estado sólido para 405nm, 488nm, 561nm e 640nm
Centrífuga de bancada intermediária	ThermoFisher Scientific	Modelo: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Ultracentrífuga de mesa Optima Max-Xp	Beckman Coulter	393315
Limpador de plasma	Diener electronic GmbH + Co. KG	Tipo de sistema: Zepto
Sonda Sonicadora (3,2 mm)	Qsonica	Nº 4418
Incubadora padrão	fichário	Modelo: 56
Misturador de tubo Waverly	Waverly	TR6E