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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local
1. Sensibilização passiva de células huRBL
- Centrifugue a suspensão pré-incubada de Ag8/soro por 5 min a 250 x g.
- Transferir 50 μL da suspensão centrifugada de Ag8/soro para cada alvéolo contendo células huRBL sem perturbar o grânulo de células Ag8.
- Inclua o controle sem antígeno, que são células sensibilizadas, mas não estimuladas (não adicionam antígeno), servindo como uma indicação para o platô/fundo do sinal inferior. Os poços de controle de fundo e de lise máxima não precisam ser sensibilizados com soro. Adicione 50 μL de meio huRBL aos poços de controle.
- Cubra a placa com a tampa e incube durante a noite a 37 °C e 5%-7% CO2.
2. Degranulação estimulada por antígeno e liberação de mediador
- Prepare a diluição do antígeno em 1x tampão de Tyrode (9,5 g/L de sais de Tyrode, 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,5 g/L de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) em dH2O) com antecedência. É necessária uma quantidade final de 100 μL por poço.
nota: Nem todo alérgeno, purificado de fontes naturais ou produzido recombinantemente, pode ser estável no tampão de Tyrode 1x. Portanto, realize testes de estabilidade no tampão de Tyrode 1x antes do procedimento de ensaio. Alternativamente, dilua 1x o tampão de Tyrode em óxido de deutério (D2O) para aumentar a relação sinal-ruído do ensaio.
- Fazer 8 diluições do antígeno de interesse de uma série de diluições de 1:10 em tubos de reação, começando com 10 ou 1 μg/mL de proteína.
NOTA: Sempre teste a série de diluição com antecedência. Como alternativa, adapte a série de diluição 1:10 (por exemplo, 1:5, 1:20 ou 1:30) para cobrir a curva de liberação completa. Além disso, a concentração inicial pode variar dependendo da configuração experimental.
- Para lavar as células huRBL revestidas na placa de 96 poços, remova primeiro o meio celular contendo soro aspirando, invertendo e batendo cuidadosamente na placa em papel absorvente.
- Lave as células com 200 μL de tampão 1x Tyrodes por poço. Trate todos os poços da mesma forma.
nota: Adicione a solução de lavagem lentamente às células para não perturbá-las.
- Deixe agir por aproximadamente 30 s e repita a etapa de lavagem três vezes no total.
- Depois de adicionar a solução de lavagem pela última vez, deixe a solução nos poços até que esteja pronta para continuar com a adição da diluição do antígeno.
nota: Evite expor as células ao ar por muito tempo.
- Transferir 100 μL de solução de antígeno para cada poço contendo as células huRBL pré-sensibilizadas.
NOTA: Se analisar vários parâmetros diferentes, transfira as amostras individuais da série de diluição para uma placa adicional de 96 poços não ligante (use o mesmo layout da placa huRBL) e transfira-as posteriormente com uma pipeta multicanal diretamente na placa de célula huRBL. Dessa forma, a exposição das células ao ar por muito tempo pode ser evitada, o que pode resultar em baixo desempenho do ensaio (sinal mais baixo/sem sinal).
- Cubra os poços de controle (lise máxima e células de fundo não sensibilizadas) com 100 μL de tampão 1x Tyrode. Não estimule esses poços de controle com o antígeno.
- Além disso, adicione 100 μL de tampão 1x Tyrode aos poços sensibilizados sem antígeno da série de diluição, o que é necessário para levar em consideração a liberação espontânea independente do antígeno de células sensibilizadas durante a análise dos dados.
- Incubar as células huRBL durante 1 h a 37 °C e 5%-7% CO2.
3. Medição de fluorescência da atividade da β-hexosaminidase
- Trate os poços do controle de lise máxima com 10 μL de Triton X-100 a 10% por poço e misture adequadamente para lisar completamente as células e obter a liberação de 100% de β-hexosaminidase.
- Adicione 50 μL de solução de substrato em uma nova placa de 96 poços não ligante. Solução de substrato para uma placa de 96 poços: 5 mL de tampão de ensaio cítrico 0,1 M, pH 4,5; e 80 μL de 4-metilumbeliferil N-acetil-β-D-glucosaminada 10 mM.
- Transferir 50 μL de sobrenadante celular de todos os poços para a nova placa contendo a solução de substrato.
NOTA: Pipete cuidadosamente o sobrenadante para fora da placa huRBL para não perturbar as células huRBL.
- Incubar a placa com solução de substrato e sobrenadante celular por 1 h a 37 °C para permitir a conversão do substrato fluorogênico.
nota: Guarde a placa huRBL para o ensaio de viabilidade celular.
- Adicione 100 μL de solução de parada (15 g/L de glicina, 11,7 g/L de NaCl dissolvido em dH2O, pH 10,7) por alvéolo.
- Meça a fluorescência com excitação de 360 nm e emissão de 465 nm usando um leitor de placas.