$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Triagem de alto rendimento (HTS) de inibição do crescimento
NOTA: A atividade inibitória do crescimento de agentes anticancerígenos contra organoides tumorais derivados de pacientes (PDOs) é avaliada medindo o conteúdo de ATP intracelular, conforme mostrado na Figura 1. Esta etapa é realizada usando um kit de ensaio de viabilidade celular disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- No dia 0, cultivar as PDOs (por exemplo, RLUN007) em frascos até que um número adequado de aglomerados de células esteja disponível para o ensaio. Um dia antes da sementeira, transferir a suspensão de DOP de um balão de 75 cm2 para um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 2 min para medir o volume do sedimento de DOP. Em seguida, ressuspender o pellet de DOP em 15 ml de meio fresco e transferi-lo de volta para um balão de 75 cm2. Cultivar as células a 37 °C em 5% de CO2,
nota: O volume de pellets de PDO necessário depende da taxa de diluição de cada PDO e do número de placas de 384 poços usadas para o ensaio. Para RLUN007, são necessários 200 μL de volume de pellets celulares para a semeadura em dez placas de 384 poços.
- No dia 1 (24 h após a troca do meio), pique as PDOs usando equipamento de fragmentação e dispersão celular (consulte a Tabela de Materiais) com um porta-filtro contendo um filtro de malha de 70 μm. Em seguida, diluir 15 mL da suspensão de PDO em 10x. Semear 40 μL da suspensão de PDO em microplacas de esferóides de fixação ultrabaixa (fundo redondo) de 384 poços (ver Tabela de Materiais) usando um dispensador de suspensão de células (ver Tabela de Materiais).
nota: Para picar aglomerados de células, recomenda-se o uso do equipamento de fragmentação e dispersão celular disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- 24 h após a sementeira (dia 2), tratar as DOP com 0,04 μl de soluções do agente de ensaio nas concentrações finais de 20 μM a 1,0 nM (10 diluições em série) utilizando um manipulador de líquidos (ver quadro de materiais).
- No dia 8 (144 h após o tratamento com a substância de ensaio), adicionar o reagente de medição de ATP intracelular aos alvéolos de ensaio. Misturar as placas com um misturador e incubar durante 10 min a 25 °C. Medir o teor de ATP intracelular sob a forma de luminescência utilizando um leitor de placas (ver Tabela de Materiais).
- Para calcular a viabilidade celular, dividir a quantidade de ATP nos alvéolos de ensaio pela quantidade de ATP nos alvéolos de controlo que contêm o veículo, subtraindo o fundo. Para calcular a taxa de crescimento ao longo de 6 dias, divida a quantidade de ATP nos poços de controle do veículo pela quantidade nos poços de controle do veículo 24 h após a semeadura.
- Calcule os valores de concentração inibitória de 50% (IC50) e área sob a curva (AUC) a partir das curvas dose-resposta usando software de análise de dados biológicos (consulte a Tabela de Materiais). O fator Z é um parâmetro adimensional que varia de 1 (separação infinita) a <0, definido como Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, onde σc+, σc-, μc+ e μc- são os desvios padrão (σ) e médias (μ) dos controles alto (c+) e baixo (c−), respectivamente.
