Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante: Uma Técnica de Alto Rendimento para Identificar Proteínas Intracelulares de Ligação ao Segundo Mensageiro de Nucleotídeos Bacterianos

1. Preparação de lisados de células inteiras

1. Inocular as cepas de coleta de E. coli K-12 ASKA ORFeome em 1,5 mL de caldo de lisogenia (LB) contendo 25 μg/mL de cloranfenicol em placas de 96 poços profundos. Crescer durante a noite (O/N) durante 18 h a 30 °C com agitação a 160 rpm. No dia seguinte, adicione isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) (0,5 mM final) às culturas O/N para induzir a expressão proteica a 30 °C por 6 h.
2. Células de pellets a 500 x g durante 10 min. Congelar os pellets a -80 °C até à utilização. Para lisar as células, adicione 150 μL de tampão de lise L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, suplementado com 2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 40 μg / mL DNase 1 e 0,5 mg / mL de lisozima) para ressuspender o pellet.
3. Congele as células a -80 °C por 30 min e depois descongele a 37 °C por 20 min. Repita este ciclo três vezes para lisar as células. Conservar os lisados a -80 °C antes de utilizar.

2. Purificação de Rel_seq e GppA

NOTA: As proteínas recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis e GppA de E. coli K-12 são usadas para sintetizar o pppGpp e ppGpp radiomarcados, respectivamente.

1. Cultive e colete células que superexpressam cada proteína.
   1. Aumente a cepa E. coli BL21 DE3 até a fase exponencial (densidade óptica (OD) ~ 0,3-0,4) em caldo LB e diminua 1 mL de cultura a 6000 x g por 5 min. Transvase o sobrenadante e ressuspenda as células com 100 μL de caldo TSB gelado (caldo LB suplementado com 0,1 g / mL PEG3350, 0,05 mL / mL de dimetilsulfóxido, 20 mM MgCl₂).
   2. Misturar os plasmídeos com o relseq e o gppA marcados com histidina, cada um com 100 ng, com as suspensões celulares acima referidas em TSB e incubar em gelo durante 30 min. Aplicar um choque térmico nas células a 42 °C durante 40 s. Colocar a mistura no gelo durante 2 min e adicionar 1 ml de caldo LB à temperatura ambiente para permitir que as células recuperem durante 1 h a 37 °C com agitação a 160 rpm.
   3. Coloque as células recuperadas em placas de ágar LB suplementadas com os antibióticos correspondentes (Rel_seq: 100 μg / mL ampicilina; GppA: 30 μg/ml de canamicina). No dia seguinte, inocular as colônias em caldo LB para iniciar pré-culturas O/N de ambas as cepas a 37 °C.
   4. Após 18 h, inocular 500 mL de meio LB com 10 mL das culturas O/N e os antibióticos correspondentes. Cultive as culturas agitando a 160 rpm a 37 °C. Quando o OD_600nm atingir 0,5-0,7, induza a expressão da proteína adicionando 0,5 mM IPTG e crescendo por 3 h a 30 °C com agitação a 160 rpm.
   5. Colete as células girando a 6084 x g por 10 min a 4 ° C. Ressuspenda o pellet em 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada e centrifugue novamente a 1912 x g por 20 min a 4 ° C. Transvase o sobrenadante e congele os pellets a -20 ° C antes de usar.
2. Purificação de afinidade do ácido nitrilotriacético (Ni-NTA)
   nota: A partir deste ponto, certifique-se de que as amostras estejam frias.
   1. Adicione 40 mL de tampão de lise gelada L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% de glicerol, 10 mM de imidazol, 10 mM de β-mercaptoetanol suplementado com inibidores de protease (comprimido sem EDTA; consulte a Tabela de Materiais) para ressuspender o pellet. Lisar as células por sonicação (amplitude de 60%, 2 s ON/4 s OFF por 8 min ON). Limpar o lisado centrifugando a 23,426 x g durante 40 min a 4 °C e continuar com o sobrenadante para purificação.
   2. Durante a centrifugação acima, prepare a resina Ni-NTA.
      1. Transfira 500 μL de resina Ni-NTA homogeneizada para uma coluna de cromatografia de polipropileno permanente e deixe repousar por 15 min e a solução de armazenamento escorrer. Lave a resina com 15 mL de água ultrapura duas vezes e, em seguida, lave a coluna com 15 mL do tampão de lise L2.
   3. Carregue o sobrenadante limpo de lisado celular da etapa 1 na coluna e deixe-o fluir. Lave a coluna com 30 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% de glicerol, 20 mM de imidazol).
   4. Eluir as proteínas com 400 μL do tampão de eluição (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% de glicerol, 500 mM de imidazol) três vezes. Em seguida, repita a eluição com mais 300 μL do tampão de eluição. Combinar as proteínas eluídas até obter um volume final de 700 μl.
3. Filtração em gel
   1. Prepare tampão de filtração em gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% de glicerol). Lave a coluna de exclusão de tamanho com um volume de coluna (25 mL) do tampão de filtração de gel.
   2. Carregue a amostra de 700 μL acima usando um loop de 500 μL, execute a 0,5 mL / min e colete 2-3 frações, cada uma com 0,5 mL de volume, contendo as respectivas proteínas.
   3. Combinar e concentrar as fracções que contêm cada uma das proteínas utilizando uma coluna de rotação e medir a concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford.

3. Síntese de ³²pppGpp e ppGpp marcados com P

1. Monte uma reação Rel_seq em pequena escala em um tubo com tampa de rosca (consulte a Tabela 1).
   nota: Trabalhe com reagentes radioativos apenas em local licenciado e com equipamento de proteção individual.
2. Incube o tubo a 37 ° C em um termomisturador por 1 h, depois a 95 ° C por 5 min e coloque no gelo por 5 min. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min e transfira o sobrenadante (sintetizado ³²P-pppGpp) para um novo tubo com tampa de rosca.
3. Para sintetizar ³²P-ppGpp de ³²P-pppGpp, transfira metade do produto ³²P-pppGpp para um novo tubo com tampa de rosca e adicione 1 μM de GppA. Incubar o tubo a 37 °C durante 10 min, a 95 °C durante 5 min e depois colocar no gelo durante 5 min.
4. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min e transfira o sobrenadante (sintetizado ³²P-ppGpp) para um novo tubo com tampa de rosca.
5. Analise os ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp executando 1 μL das amostras em uma placa de cromatografia em camada fina (TLC) (placas TLC de celulose modificada com polietilenoimina) usando o 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, como fase móvel.
   nota: Use o guanosina 5'-trifosfato marcado com ^α-32P (³²P-α-GTP) como controle.
6. Seque a placa TLC completamente, coloque-a entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de armazenamento de fósforo por 5 min. Visualize e quantifique os sinais usando um imageador de fósforo.
   nota: Quando as proporções de ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp são superiores a 85%, uma reação em larga escala (500 μL, suficiente para a triagem de 20 placas de 96 poços) pode ser montada e sintetizada usando a Tabela 1.

4. Triagem DRaCALA das proteínas-alvo de (p)ppGpp

1. Descongele e transfira 20 μL de lisados de células inteiras para uma placa de microtitulação de fundo em V de 96 poços. Adicione 2,5 U/poço da endonuclease de Serratia marcescens e incube a 37 °C por 15 min para reduzir a viscosidade do lisado. Coloque os lisados no gelo por 20 min.
2. Misture os ³²P-ppGpp e ³²P-ppGpp em uma proporção de 1:1 e adicione 1x tampão de lise L1 para tornar a concentração final de (p)ppGpp igual a 4 nM.
   nota: Dada a semelhança química entre pppGpp e ppGpp, uma mistura de ambos os produtos químicos simplificará o processo de triagem.
3. Use uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas para adicionar e misturar 10 μL da mistura (p)ppGpp com o lisado celular. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
4. Lave a ferramenta de pino 96 x colocando-a em uma solução de detergente não iônico a 0.01% por 30 s e seque-a em papel de seda por 30 s. Repita a lavagem da ferramenta de pino 3x.
5. Coloque a ferramenta de pino nas placas de amostra de 96 poços acima e aguarde 30 s. Levante a ferramenta de pino para cima e coloque-a diretamente para baixo em uma membrana de nitrocelulose por 30 s.
   nota: Se faltar um ponto, localize 2 μL das amostras correspondentes com uma pipeta e pontas filtradas. É aconselhável fazer uma mancha duplicada da mesma amostra, conforme indicado abaixo.
6. Seque a membrana por 5 min em RT. Coloque a membrana entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 min. Visualize usando um gerador de imagens de fósforo.

5. Quantificação e identificação de potenciais proteínas-alvo

1. Use o software de análise associado ao gerador de imagens de fósforo para abrir o arquivo .gel das placas visualizadas. Use a função de análise de matriz para definir os 96 pontos configurando uma grade de 12 colunas x 8 linhas.
2. Defina círculos grandes para circunscrever a borda externa de todas as manchas (veja a Figura 1). Exporte o Volumn+Background e a Area dos grandes círculos definidos e salve em uma planilha.
   nota: Se necessário, reposicione cada círculo individual para se sobrepor perfeitamente às manchas e redimensione cada círculo individual para torná-lo um pouco maior do que a mancha real.
3. Diminua os círculos definidos para circunscrever os pequenos pontos internos. Exporte o Volumn+Background e a Área dos pequenos círculos definidos e salve em uma planilha.
4. Calcule as frações de ligação na planilha usando a equação da Figura 1 e plote os dados. Identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.

Tabela 1: Montagem de informações para as reações de síntese em pequena e grande escala de ³²pppGpp marcados com P. *O tampão Relseq 10x contém 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abreviatura: pppGpp = pentafosfato de guanosina.

Figura 1: Quantificação e cálculo da fração de ligação. Veja o texto para detalhes. Resumidamente, as manchas DRaCALA serão analisadas desenhando dois círculos que circunscrevem toda a mancha e o ponto escuro interno (ou seja, o (p)ppGpp retido devido à ligação da proteína testada). O sinal de ligação específico é o sinal radioativo do círculo interno (S1) após subtrair o sinal de fundo não específico (calculado por A1 × ((S2-S 1)/(A2-A 1))). A fração de ligação é o sinal de ligação específico dividido pelo sinal radioativo total (S2). Abreviaturas: DRaCALA = Ensaio de Ação Capilar Radial Diferencial do Ligante; p)ppGpp = pentafosfatos e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente.