Ensaio de imagem por sonda fluorescente: uma técnica para visualizar o estresse oxidativo nas células organoides intestinais cultivadas tratadas com indutor de espécies reativas de oxigênio

Resumo

Fonte: Stedman, A. et al., Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível a espécies reativas de oxigênio. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve a técnica de visualização do estresse oxidativo em organoides cultivados. Este trabalho ajuda a entender o nível de estresse oxidativo devido ao acúmulo de ROS nos vários tipos celulares presentes em um organoide após o tratamento com diferentes moduladores de ROS.

Protocolo

1. Visualização do estresse oxidativo em organoides 3D por microscopia confocal

1. Pegue os organoides plaqueados nas câmaras de 8 poços μ-Slide e adicione 1 μL de N-acetilcisteína ou solução estoque de NAC nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 1 mM.
2. Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Adicionar 1 μL de solução reserva tBHP nos alvéolos correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
4. Incubar durante 30 min a 37 °C e 5% de CO₂.
5. Adicionar 1 μL por alvéolo da diluição de 1,25 mM da sonda fluorogénica para obter uma concentração final de 5 μM.
6. Adicionar 1 μl por alvéolo da diluição de 1,25 mg/ml de Hoechst para obter uma concentração final de 5 μg/ml.
7. Incubar durante 30 min a 37 °C e 5% de CO₂.
8. Remova o meio sem perturbar o BMM. Delicadamente, adicione 250μL de DMEM quente sem vermelho de fenol.
   nota: Se uma aquisição de longo prazo for planejada, adicione compostos de fatores de crescimento ao DMEM sem vermelho de fenol.
9. Visualize os organoides usando um microscópio confocal equipado com uma câmara térmica e suprimento de gás que detecta a sonda fluorogênica (ROS).
   nota: A excitação/emissão (ex/em) para a sonda fluorogênica é 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) é 361/486 e ex/em para GFP (células-tronco intestinais dos camundongos Lgr5-GFP) é 488/510. Uma objetiva de imersão em óleo de 63x é usada para detectar sinais em células-tronco. Não altere as configurações do laser entre as amostras. Uma objetiva de 20x pode ser usada para permitir uma visão geral da produção de ROS.
10. Use o controle positivo para configurar a intensidade do laser e o tempo de exposição para o sinal ROS e verifique se esse sinal é menor no controle negativo.
11. Usando a ocular, filtre o slide para identificar os organoides GFP que expressam e ajuste a intensidade do laser.
    nota: Esta etapa é executada manualmente.
12. Defina posições para obter uma imagem costurada de todo o organoide. Configure uma pilha z de 25 μm (tamanho do passo de 5 μm) para obter uma seção dos organoides mostrando uma camada de células.
    nota: Consulte o manual do usuário do microscópio para otimizar a configuração. Usando células vivas, a aquisição deve ser feita dentro de 1 h após o término da incubação.
13. Abra as imagens em um software de processamento de imagem de código aberto (consulte Tabela de materiais).
14. Percorra a pilha z e escolha a seção em que o meio dos organoides está bem representado e crie uma nova imagem com a área selecionada.
15. Quantifique as imagens de acordo com as etapas a seguir.
    1. Selecione a ferramenta de linha à mão livre.
    2. Desenhe uma linha seguindo os núcleos.
       nota: Selecione apenas regiões que apresentam células GFP-positivas se apenas células-tronco forem analisadas.
    3. Aumente a largura da linha para cobrir a camada de células com a linha sem incluir os detritos luminais.
    4. Selecione o canal para o sinal ROS e meça a intensidade de fluorescência na região selecionada e anote os valores.
    5. Desenhe uma linha onde não haja sinal e meça a intensidade fluorescente do fundo que será subtraída do valor anterior para obter a intensidade final.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
mouses
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	O Laboratório Jackson
Meio de cultura de crescimento
DMEM F12 avançado (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Penicilina-estreptomicina (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentração de estoque: 100x (10.000 unidades/mL de penicilina e 10.000 μg/mL de estreptomicina)
FLuoroBrite DMEM (DMEM sem vermelho de fenol)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	estoque a 10 mg/mL
Fator de crescimento Matrigel reduzido, vermelho de fenol livre (matriz da membrana basal)	Corning	356231	uma vez recebidas, descongelar no frigorífico, conservar durante 1h no gelo e fazer alíquotas de 500 ml e conservar a -20 °C
μ-Slide 8 Câmaras de poços	Ibidi	Rolamento 80826
N-acetilcisteína (NAC)	sigma	Rolamento A9165
solução de hidroperóxido de terc-butila (tBCHP) (70% em peso. Em H2O2)	sigma	458139
Programas e Equipamentos
Fiji/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ geração de imagens de downloads
Observador.Z1	Zeiss		sistema confocal
Opterra (confocal de campo varrido)	Bruker		sistema confocal
câmera EMCCD de alta velocidade Evolve Delta 512	Fotometria		sistema confocal
prisma	Software GraphPad		análise estatística