Ensaio de citometria de fluxo para quantificar o estresse oxidativo: um ensaio para quantificar espécies reativas de oxigênio em organoides intestinais usando sondas fluorogênicas

Resumo

Fonte: Stedman, A., et al., Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível a espécies reativas de oxigênio.J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio de citometria de fluxo para quantificar os níveis de ROS em organoides intestinais 3D obtidos de camundongos transgênicos que expressam GFP. Este método fornece um modelo experimental in vitro para investigar a eficácia dos compostos de teste na produção de ROS.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de reagentes e materiais para cultura de organoides intestinais

1. Para preparar o meio de cultura de crescimento, misture DMEM/F-12 avançado suplementado com 1x glutamina, 1x solução de penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de EGF murino, 20 μg/mL de Noggin murino 500 ng/mL de R-Spondin1 de camundongo (ver Tabela de Materiais). Deixe o meio em temperatura ambiente (TR) durante a extração da cripta.
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Resultados

Figura 1: Imagens representativas de criptas e organoides.(A) Exemplo de fração F1 obtida após a primeira incubação com EDTA, enriquecida em vilosidades (quadrado), com alguns detritos (estrela) e criptas (círculo). (B) Exemplo de fração F4 enriquecida em criptas. (C) Suspensão apresentando apenas criptas isoladas obtidas após a filtração com um filt.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
mouses
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	O Laboratório Jackson
Meio de cultura de crescimento
DMEM F12 avançado (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Suplemento B-27, menos vitamina A	ThermoFisher	12587010	Concentração de estoque: 50x
GlutaMAX (glutamina)	ThermoFisher	35050038	Concentração de estoque: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Concentração de estoque: 1 m
Murine EGF	R&d	2028-POR DEUS-200	Concentração de estoque: 500 μg/mL em PBS
noggin murino	R&d	1967-NG/CF	Concentração de estoque: 100 μg/mL em PBS
R-espondina murina1	R&d	3474-RS-050	Concentração de estoque: 50 μg/mL em PBS
Suplemento N-2	ThermoFisher	17502048	Concentração de estoque: 100x
Penicilina-estreptomicina (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentração de estoque: 100x (10.000 unidades/mL de penicilina e 10.000 μg/mL de estreptomicina)
material
Filtro de células de 70 μm	Corning	Rolamento 352350
Fundo redondo de 96 poços	Corning	3799
tesoura de ponta esférica	Ferramentas de Belas Ciências GMBH	14086-09
Reagente CellROX® Vermelho Escuro	ThermoFisher	C10422
DAPI (4',6-diamidino-2-fenillindol, diclorhidrato) (sonda fluorgénica)	ThermoFisher	D1306	estoque a 10 mg/mL
DPBS 1x sem cálcio sem magnésio (DPBS)	ThermoFisher	14190144
Fator de crescimento Matrigel reduzido, vermelho de fenol livre (matriz da membrana basal)	Corning	356231	uma vez recebidas, descongelar no frigorífico, conservar durante 1h no gelo e fazer alíquotas de 500 ml e conservar a -20 °C
N-acetilcisteína (NAC)	sigma	Rolamento A9165
solução de hidroperóxido de terc-butila (tBCHP) (70% em peso. Em H2O2)	sigma	458139
Enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol (tripsina)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	sigma	Y0503	Inibidor de rocha a ser usado para minimizar a morte celular após dissociação do tecido
Programas e Equipamentos
Attune NxT (citômetro de fluxo)	ThermoFischer		Analisador de citômetro de fluxo
FlowJo	BD Biociência		Análise FACS
prisma	Software GraphPad		análise estatística