Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de reagentes e materiais para cultura de organoides intestinais
- Para preparar o meio de cultura de crescimento, misture DMEM/F-12 avançado suplementado com 1x glutamina, 1x solução de penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de EGF murino, 20 μg/mL de Noggin murino 500 ng/mL de R-Spondin1 de camundongo (ver Tabela de Materiais). Deixe o meio em temperatura ambiente (TR) durante a extração da cripta.
nota: Congelar o meio não utilizado em alíquotas a -20 °C. Evitar congelar e descongelar.
- Encha um tubo de 50 mL com 40 mL de Advanced DMEM/F-12 e mantenha-o no gelo.
nota: Manter o meio não utilizado a 4 °C. Ele será usado para passagem de organoide.
- Pré-aqueça as placas de cultura de células (fundo redondo de 96 poços) na incubadora a 37 °C.
- Descongelar alíquotas da matriz de membrana basal (BMM) (ver Tabela de Materiais) no gelo (antes de iniciar o protocolo ou pelo menos 1 h antes de plaquear criptas).
nota: O BMM solidificará rapidamente se não for mantido frio.
- Prepare a solução de lavagem/lavagem adicionando solução de penicilina-estreptomicina a 1% ao DPBS (DPBS-P/S).
- Encha uma placa de 100 mm com 10 mL de DPBS-P/S frio. Encha seis tubos de 15 mL com 10 mL de DPBS e rotule-os de F1 a F6.
- Prepare 30 ml de solução de EDTA a 10 mM por diluição a partir de EDTA 0,5 M em DPBS. Encha dois tubos de 15 mL com 10 mL de EDTA 10 mM e rotule-os como E1 e E2.
- Mantenha todas as soluções pré-resfriadas a 4°C e mantenha-as no gelo durante o procedimento.
2. Cultura de organoides intestinais
- Sacrifique um camundongo Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 a 10 semanas de idade de acordo com as regras e regulamentos nacionais.
- Colete 5-8 cm do jejuno abrangendo a região entre o duodeno (5 cm do estômago) e o íleo (10 cm do ceco) e mantenha em DPBS-P / S frio no gelo.
- Limpe o conteúdo intestinal lavando com 5-10 mL de DPBS-P/S.
frio
nota: As seringas de lavagem caseiras podem ser obtidas conectando uma ponta de 200 μL a um bico de seringa de 10 mL.
- Abra o intestino longitudinalmente usando uma tesoura de ponta esférica (ver Tabela de Materiais) (para evitar danificar o tecido).
- Usando uma pinça, transfira o tecido para uma placa de Petri contendo DPBS-P / S frio em temperatura ambiente e agite-o para enxaguar.
- Com uma pipeta de plástico Pasteur, pegue o intestino por aspiração e transfira-o para um tubo de 15 mL rotulado como E1 contendo 10 mL de EDTA frio a 10 mM.
- Inverta o tubo 3 vezes e incube no gelo por 10 min.
- Usando uma pipeta de plástico Pasteur, transfira o tecido em tubo F1 contendo 10 mL de DPBS. Vórtice por 2 min (em vórtice normal, segurando o tubo com a mão e garantindo que o intestino gire bem).
- Colocar 10 μL da fração em uma placa de Petri e avaliar a qualidade da fração ao microscópio.
nota: Todas as etapas do vórtice são executadas na velocidade máxima e a qualidade de cada fração deve ser avaliada ao microscópio (Figura 1).
- Com uma pipeta de plástico Pasteur, pegue o intestino por aspiração e transfira-o em tubo F2 contendo 10 mL de DPBS e vórtice por 2 min.
- Repita a etapa 2.10, transferindo o tecido no tubo F3 contendo 10 mL de DPBS e vórtice por 2 min.
- Repita a incubação de EDTA como na etapa 2.6, transferindo o tecido em tubo E2 contendo 10 mM de EDTA.
- Inverta o tubo 3 vezes e incube no gelo por 5 min.
- Repita a etapa 2.10, transferindo o tecido em tubo F4 contendo 10 mL de DPBS e vórtice por 3 min.
- Repita a etapa 2.14, transferindo o tecido no tubo F5 contendo 10 mL de DPBS e vórtice por 3 min.
- Repita a etapa 2.15, transferindo o tecido no tubo F6 contendo 10 mL de DPBS e vórtice por 3 min.
- Combine as melhores frações filtradas por gravidade através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL (no gelo) para eliminar vilosidades e detritos significativos.
nota: Normalmente, F5 e F6 são as frações que contêm numerosas criptas e menos detritos.
- Girar as criptas a 150 x g a 4 °C durante 3 min.
- Esvazie o tubo, interrompa o pellet mecanicamente e adicione 5 mL de DMEM/F12 frio.
- Colocar 10 μL da suspensão em uma placa de Petri e contar manualmente ao microscópio o número de criptas presentes na alíquota.
nota: Não conte células individuais ou pequenos detritos.
- Calcule o volume (V) da suspensão das criptas necessário em μL, considerando que 300 criptas são plaqueadas por poço, W é o número de poços e N é o número de criptas contadas em 10 μL da suspensão. Transfira as criptas para um novo tubo de 15 mL.
nota: V = 300 x L x 10/N. Se um pequeno volume for usado no experimento planejado, um tubo de centrífuga de 1,5 mL pode ser usado.
- Girar as criptas a 200 x g a 4 °C durante 3 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta.
- Interrompa mecanicamente o pellet e adicione suavemente o meio de cultura de crescimento para obter uma concentração de 90 criptas / μL.
- Adicione 2 volumes de BMM não diluído para obter uma concentração final de 30 criptas / μL. Pipete cuidadosamente para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
nota: Sempre mantenha o tubo no gelo para evitar a solidificação do BMM.
- Placa 10 μL das criptas / BMM misturadas em cada poço. Para análise de citometria de fluxo, use placas de fundo redondo de 96 poços. Distribua 10 μL no centro de cada poço como uma cúpula.
nota: Placa dos organoides como uma camada fina para o ensaio de imagem para permitir sua imagem em profundidade.
- Deixe a placa por 5 min em RT para permitir que o BMM solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 15 min.
- Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço, tomando cuidado para não desprender o BMM.
- Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Realize a análise de ROS entre os dias 4 e 6 de cultura. Caso contrário, mude o meio e divida os organoides após o aparecimento de várias estruturas de brotamento longo e quando as células mortas se acumularem nos lúmens dos organoides.
3. Passagem de organoides
- Comece a passar organoides do intestino delgado a partir do6º dia de cultivo, quando estruturas significativas de brotamento se formaram e os lúmens dos organoides ficaram escuros.
nota: O lúmen do organoide torna-se escuro devido ao acúmulo de células mortas, detritos e muco. Evite deixar os organoides crescerem demais antes de se dividirem. A taxa de divisão depende do crescimento dos organoides. Recomenda-se a passagem dos organoides com uma proporção de 1:2 no dia 6 e 1:3 no dia 10.
- Encha um tubo de 15 mL com 4 mL de Advanced DMEM/F-12 frio e mantenha-o no gelo.
nota: Aqui, são fornecidos volumes para uma placa de cultura de 96 poços. Se um formato diferente for usado, ajuste o volume de acordo.
- Aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta ou uma bomba de vácuo dos poços sem tocar nas cúpulas do BMM e descarte-o.
- Adicione 100 μL de DMEM/F-12 avançado frio por poço. Pipete para cima e para baixo para quebrar o BMM e transfira o conteúdo do poço para o tubo de 15 mL.
- Lave o poço com 200 μL de DMEM/F-12 avançado a frio e colete-o no mesmo tubo.
nota: Se passar por vários poços da mesma condição experimental, o conteúdo dos poços pode ser agrupado no mesmo tubo coletor de 15 mL.
- Gire o tubo coletor de 15 mL a 100 x g por 5 min a 4°C.
- Descarte o sobrenadante e adicione 1mL de Advanced DMEM/F-12 frio ao pellet. Usando uma ponta P1000, pegue uma ponta P10 (sem filtro) e pipete para cima e para baixo pelo menos 20 vezes.
- Adicione 4 mL de DMEM/F-12 avançado frio ao tubo. Gire a 300 x g por 5 min a 4°C.
- Aspirar o sobrenadante com uma pipeta ou uma bomba de vácuo sem perturbar o sedimento. Em seguida, interrompa o pellet mecanicamente.
- Adicionar a MCO diluída em meio de cultura de crescimento (proporção de 2:1). Pipete cuidadosamente para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
- Placa 10 μL das criptas / BMM misturadas em cada poço.
- Mantenha a placa por 5 min em RT para permitir que o BMM solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 15 min.
- Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço.
nota: Tenha cuidado para não soltar o BMM.
- Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
4. Preparação de reagentes e materiais para avaliação do estresse oxidativo em organoides intestinais
- Prepare uma solução-mãe a 250 mM do inibidor N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabela de Materiais) e ressuspenda 10 mg com 245 μL de DPBS. Use na concentração final de 1 mM.
- Prepare uma solução estoque de 50 mM de hidroperóxido de terc-butila indutor (tBHP), 70% em água, e dilua 3,22 μL com 496,8 μL de DPBS. Use na concentração final de 200 μM.
- Para o estudo de citometria de fluxo, preparar uma solução de trabalho a 250 μM de uma sonda fluorogénica (ver quadro de materiais) diluindo a solução-mãe a 1/10 em DMSO. Use na concentração final de 1 μM.
nota: Conforme indicado nas instruções do fabricante, a sonda fluorogênica é sensível à luz e ao oxigênio. Estoques e alíquotas não devem ser abertos e fechados muitas vezes.
- Preparar uma solução final de DAPI 0,1 μg/mL em DPBS, para ser usada para discriminação de células mortas no ensaio de citometria de fluxo.
nota: Essas etapas descrevem o uso de controles negativos e positivos que devem ser incluídos em qualquer ensaio, usando as condições indicadas na Figura 2A. O ensaio pode ser usado para testar compostos antioxidantes ou pró-oxidantes. As etapas são as mesmas, e a única diferença é quando os compostos são adicionados antes de usar o corante fluorogênico.
5. Quantificação do estresse oxidativo nos organoides dissociados usando citômetro de fluxo
- Adicionar 1 μL de solução-mãe de NAC nos alvéolos para controlos negativos para obter uma concentração final de 1 mM.
nota: Use os organoides revestidos nas placas de fundo redondo de 96 poços.
- Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Adicionar 1 μL de solução reserva tBHP nos alvéolos correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
- Incubar durante 30 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Com uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM conectado e transfira-o para outra placa inferior redonda de 96 poços. Mantenha este prato de lado.
- Adicione 100 μL de tripsina e, com uma pipeta multicanal, pipete para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para destruir o BMM.
- Incubar durante um máximo de 5 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Com uma pipeta multicanal, pipete para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para dissociar os organoides.
- Gire a 300 x g por 5 min em RT.
- Rejeitar o sobrenadante invertendo a placa. Adicione de volta o meio coletado na etapa 6.3 aos poços correspondentes e ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
- Adicionar a sonda fluorogénica à concentração final de 1 μM. Adicionar 1 μL por alvéolo a partir da diluição de 250 μM e incubar durante 30 min a 37 °C e 5% de CO2,
nota: Não adicione a sonda fluorogênica aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B).
- Gire a 300 x g por 5 min em RT.
- Ressuspenda as células com 250 μL de solução de DAPI 0,1 μg / mL. Transfira as amostras nos tubos de citometria de fluxo adequados, mantenha os tubos no gelo e prossiga com a análise.
nota: Adicione PBS em vez de DAPI aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B).
- Otimize as configurações de tensão de dispersão direta e lateral no controle não corado e tensões de laser para cada fluoróforo usando amostras monocoradas.
- Usando uma estratégia de gating apropriada (Figura 3A), colete um mínimo de 20.000 eventos.
NOTA: 50.000 eventos são preferidos. As configurações detalhadas de aquisição variam de acordo com o instrumento usado.
