Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

Resumo

Fonte: Yang, W. S. et al., Ensaio de SUMOilação in vitro para estudar a atividade da ligase SUMO E3. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o método in vitro para SUMOilação de proteínas de substrato usando uma cascata enzimática sequencial. Além disso, o status SUMOilado da proteína é identificado usando a técnica de eletroforese e immunoblotting.

Protocolo

1. Preparação de construções de expressão de baculovírus

1. Purifique a ligase SUMO E3 K-bZIP clonando o cDNA de K-bZIP em um vetor de baculovírus de expressão dupla (consulte a Tabela de Materiais) com uma etiqueta de epítopo N-terminal. Tivemos sucesso usando uma tag octapeptide (indicada em todo o protocolo como vector-tag-K-bZIP).
   nota: O modelo de DNA para clonagem da reação em cadeia da polimerase (PCR) K-bZIP é o cDNA transcrito reversamente do RNA isolado de células TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 após o tratamento com doxiciclina.
   1. Transfira o cDNA K-bZIP de comprimento total para o vetor de expressão dupla com locais de clonagem CpoI. CpoI digere o produto da PCR e 1 μg do vetor de dupla expressão a 37 °C durante 3 h.
   2. Separe e extraia o DNA digerido após eletroforese em um gel de agarose a 0,8%. Ligue a sequência (K-bZIP) e o vetor por T4 DNA ligase a 16 °C durante 30 minutos, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   3. Adicione 5 μL de DNA de ligação a 50 μL de células de E. coli competentes "A" (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 1,5 mL. Coloque no gelo por 30 min. Em seguida, incube o tubo de 1,5 mL em banho-maria a 42 °C por 45 s e coloque imediatamente o tubo no gelo por 3 min.
   4. Adicione 600 μL S.O.C. meio (0,5% (p / v) de extrato de levedura, 2% (p / v) de triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 20 mM de MgSO₄ e 4% (p / v) de glicose) no tubo e incube a 37 ° C por 1 h. Em seguida, centrifugue o tubo à temperatura ambiente por 3 min a 600 x g.
   5. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet com 60 μL de meio Luria-Bertani (LB; 1% (p / v) de triptona, 0,5% (p / v) de extrato de levedura e 85 mM de NaCl) e espalhe em placas de ágar LB contendo 100 μg / mL de ampicilina. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C durante 16 h.
   6. Selecione 1 colônia para inocular em meio LB de 5 mL contendo 100 μg / mL de ampicilina e cultive a 37 ° C por 16 h com agitação de 250 rpm. Em seguida, extraia o plasmídeo, vector-tag-K-bZIP, por um kit de extração de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Gere o bacmid recombinante que abriga a tag-K-bZIP pela transformação da tag vetorial-K-bZIP em células competentes de E. coli "B" (ver Tabela de Materiais).
   1. Misture 0,2 μg de plasmídeo vector-tag-K-bZIP e 100 μL de E competente. coli células "B" em um tubo de 1,5 mL e coloque no gelo por 30 min. Incubar o tubo em banho-maria a 42 °C durante 45 s e colocar imediatamente o tubo no gelo durante 3 min.
   2. Adicione 900 μL de meio S.O.C. no tubo e incube a 37 °C por 4 h com rotação a 50 rpm. Em seguida, pegue 10 μL do meio e adicione mais 50 μL de meio S.O.C para espalhar em placas de ágar LB contendo 50 μg / mL de canamicina, 7 μg / mL de gentamicina, 10 μg / mL de tetraciclina, 100 μg / mL de substrato de galactosidase e 40 μg / mL de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), e incubar as placas durante 48 h a 37 °C.
   3. Inocular uma colónia branca num meio LB de 5 ml contendo 50 μg/ml de canamicina, 7 μg/ml de gentamicina e 10 μg/ml de tetraciclina. Incubar a 37 °C com agitação de 250 rpm durante 16 h.
   4. Isole o DNA bacmid recombinante que abriga o tag-K-bZIP, quantifique e ressuspenda a uma concentração de 1 μg / μL.
3. Gere baculovírus recombinantes expressando tag-K-bZIP transfectando 1 μg de DNA bacmid recombinante contendo tag-K-bZIP em células Sf9 em um poço de uma placa de 6 poços.
   1. Semeie 2 x 10⁶ células Sf9 (ver Tabela de Materiais) em 2 mL de meio de inseto Grace's fornecido com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de gentamicina em cada poço de uma placa de 6 poços e, em seguida, incube a 27 ° C por 1 h.
   2. Manter uma cultura de fase logarítmica de células Sf9 em meio de inseto de Grace fornecido com 10% de FBS, 1% de gentamicina e 1% de detergente C (ver Tabela de Materiais) a 27 ° C em suspensão orbital a 140 rpm. Conte as células usando um hemocitômetro e coloração com azul de tripano; a viabilidade celular deve exceder 95%. Mantenha as células usando uma proporção de subcultivo de 1:3 a cada 2-3 dias (densidade mínima ~ 0,5 x 10⁶ células / mL).
   3. Adicione 2 μL de DNA bacmid (1 μg / μL) e 98 μL de meio de soro reduzido (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de 2 mL. Em seguida, adicione 4 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais) ao tubo e misture bem. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Adicione esta mistura de transfecção (104 μL) em cada poço e incube a 27 ° C por 12-16 h.
   5. Remova o meio esgotado com aspiração suave e substitua por 2 mL de meio de inseto fresco da Grace fornecido com 10% de FBS e 1% de gentamicina. As células Sf9 aderem frouxamente à superfície da placa e não serão perturbadas com aspiração suave.
4. Colete o baculovírus recombinante após a transfecção e amplifique o baculovírus para obter estoques de alto título (P1) para experimentos futuros.
   1. 72 h após a troca do meio, raspe as células Sf9 usando um elevador de células estéril, colete o sobrenadante de cada poço individual em um tubo de 1,5 mL e vore por 10 s.
   2. Centrifugue a 4 °C por 3 min a 150 x g. Colete sobrenadante como baculovírus P0 e alíquota em tubos de 1,5 mL (1 mL de baculovírus em cada tubo). Conservar a -80 °C.
   3. Semeie 1 x 10⁷ células Sf9 em 10 mL de meio de inseto Grace's fornecido com 10% de FBS e 1% de gentamicina em uma placa de Petri de 10 cm e incube a 27 ° C por 1 h.
   4. Para amplificação de baculovírus recombinantes que expressam tag-K-bZIP, adicione 0,5 mL de baculovírus P0 às células Sf9 semeadas e incube a 27 ° C por 48 h.
   5. Colete o sobrenadante como baculovírus P1 em um tubo de 15 mL e armazene a 4 ° C por até 1 mês.

2. Purificação de K-bZIP

1. Mantenha uma cultura de fase logarítmica de células Sf9 em meio de inseto de Grace fornecido com 10% de FBS, 1% de gentamicina e 1% de detergente C a 27 ° C em suspensão orbital a 140 rpm, conforme descrito na etapa 1.3.2.
2. No dia da transdução, adicione 1 mL de sobrenadante contendo baculovírus (P1) em 250 mL de células Sf9 com densidade de 2 x 10⁶ células/mL.
3. Incubar células Sf9 por 72 h a 27 ° C em um agitador orbital com agitação de 140 rpm e, em seguida, coletar por centrifugação a 2.740 x g por 15 min a 4 ° C.
4. Remova o sobrenadante e lise os pellets de células em tampão de lise de 10 mL (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, detergente A a 1% (ver Tabela de Materiais), glicerol a 2%, coquetel de inibidores de protease) e gire a 50 rpm usando um misturador de suspensão a 4 ° C por 30 min.
5. Centrifugue o lisado de células a 15.000 x g por 15 min para coletar o sobrenadante.
6. Para purificar o tag-K-bZIP, incubar os lisados celulares (10 mL) com 50 μL de esferas magnéticas marcadas com anticorpos em tubos de polipropileno de 14 mL e girar a 50 rpm por 3 h a 4 ° C usando um misturador de suspensão. Após a captura de proteína, esfolar os grânulos a 800 x g de centrifugação por 30 s a 4 ° C. Remova a maior parte do sobrenadante, ressuspenda os grânulos no volume residual de cerca de 1 mL e transfira para um tubo de 1,5 mL para lavagem.
7. Lave a proteína capturada colocando o tubo que contém as esferas em um suporte magnético e remova o sobrenadante assim que as esferas magnéticas estiverem totalmente aderidas à lateral do tubo.
8. Lave as esferas com tampão de lise quatro vezes.
   1. Adicione 1 mL de tampão de lise em tubos de 1,5 mL e inverta os tubos 10 vezes. Colocar o tubo de 1,5 ml num suporte magnético e retirar o sobrenadante conforme descrito em 2.7.
   2. Repita a etapa anterior mais 3 vezes.
9. Lave as esferas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) uma vez.
   1. Adicione 1 mL de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄) em tubos de 1,5 mL e inverta os tubos 10 vezes.
   2. Coloque o tubo de 1,5 mL em um suporte magnético e remova o sobrenadante.
10. Eluir a proteína tag-K-bZIP das esferas magnéticas marcadas com anticorpos adicionando 100 μL de octapeptídeo de 150 μg/mL diluído em PBS em um tubo de 1,5 mL. Gire o tubo por 10 min a 50 rpm por um misturador de suspensão à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo de volta no suporte magnético e colete o sobrenadante contendo K-bZIP em um tubo limpo de 1,5 mL.
11. Analise 1-5 μL de proteína tag-K-bZIP purificada por SDS-PAGE seguida de coloração com azul de Coomassie. Carregue amostras de 2 μg, 1 μg e 0,5 μg de albumina de soro bovino (BSA) no mesmo gel e use-o para quantificação com um programa de processamento de imagem, como o ImageJ. Estime a concentração de K-bZIP em comparação com os padrões BSA.
12. O K-bZIP purificado está agora pronto para ser usado em cada ensaio de SUMOilação. Diluir o K-bZIP em PBS até uma concentração final de 100 ng/μl e conservar em pequenas alíquotas a -80 °C.

3. Ensaio de SUMOilação

1. Adicione 3 μL de 100 ng/μL de tag-K-bZIP purificado na mistura principal de cada reação de SUMOilação in vitro. Os componentes da master mix contêm 1 μL de tampão proteico, 1x tampão SUMOilação, 0,5 μL de proteína p53 (0,5 mg/mL), 25 nM de enzima ativadora E1 (conc. estoque: 1 μM), 50 nM de enzima conjugadora E2 (conc. estoque: 10 μM) e 250 nM cada um dos peptídeos SUMO (SUMO-1, SUMO-2 ou SUMO-3; conc. estoque: 5 μM) para um volume final de 17 μL.
2. Misture o conteúdo suavemente e incube a reação a 30 °C por 3 h. Pare a reação adicionando 20 μL de tampão de carregamento 2x SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% de dodecil sulfato de sódio, 0,2% (p/v) de azul de bromofenol, 20% (v/v) de glicerol e 200 mM de β-mercaptoetanol) e desnature as amostras a 95 °C por 5 min.
3. Separe as amostras no SDS-PAGE, transfira as proteínas separadas para a membrana de PVDF usando um aparelho de transferência eletroforética semi-seco e analise por Western blot usando anticorpo anti-p53.
   1. Configure o aparelho de gel e carregue 20 μL de amostra em poços de gel.
   2. Execute o gel a 10% em uma corrente constante a 80 V por cerca de 120 min (até que a banda de corante atinja o fundo do gel). Após a conclusão da eletroforese, desligue a fonte de alimentação.
   3. Desconecte o aparelho de gel e os de gel para retirar o gel e flutue o gel em tampão de transferência semi-seco (48 mM Tris-HCl, 39 mM de glicina, 20% de metanol) por 5 min.
   4. Pegue outro recipiente e mergulhe a membrana de PVDF em metanol por 1 min. Em seguida, retire o PVDF do metanol e coloque no tampão de transferência semi-seco. Agite suavemente a membrana por 5 min.
   5. Remova a tampa de segurança do aparelho eletroforético semi-seco.
   6. Pré-molhe o papel de filtro e prepare um sanduíche de gel no ânodo de platina inferior da seguinte forma: papel de filtro, membrana de PVDF, gel e papel de filtro.
   7. Prenda a placa catódica e a tampa de segurança e, em seguida, execute o borrão a 15 V de corrente constante por 90 min. Desligue a fonte de alimentação, desconecte o aparelho semi-seco e retire a membrana de PVDF.
   8. Bloqueie a membrana de PVDF com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em tampão TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% de detergente B (ver Tabela de Materiais), pH 7,6)) à temperatura ambiente por 1 h com agitação de 30 rpm por agitador orbital.
   9. Hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-p53 diluído (1:1.000) em tampão de bloqueio por 12-16 h a 4 °C com agitação de 30 rpm usando um misturador de suspensão.
   10. Retire a membrana de PVDF para um recipiente e coloque no TBST. Enxágue a membrana de PVDF com TBST mais duas vezes.
   11. Mergulhe a membrana de PVDF em TBST por 30 min com agitação de 45 rpm por agitador orbital.
   12. Hibridizar a membrana de PVDF com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) diluído (1:4.000) em tampão de bloqueio por 1 h em temperatura ambiente com agitação de 30 rpm usando um misturador de suspensão.
   13. Lave a membrana de PVDF com TBST 3 vezes conforme descrito na etapa 3.4.10.
   14. Mergulhe a membrana de PVDF em TBST por 30 min com agitação de 45 rpm usando um misturador de suspensão. Remover o TBST e adicionar PBS para preservar a membrana de PVDF a 4 °C durante um máximo de 12 h.
   15. Misture o substrato quimioluminescente aprimorado (substrato ECL) reagente 1 e 2 (1:1) (consulte a Tabela de Materiais). Remova a membrana de PVDF do PBS, seque brevemente com uma toalha de papel ou limpador leve para absorver o excesso de umidade e adicione imediatamente 400 μL de reagente ECL à superfície de cada membrana por 3-5 min. Remova o excesso de reagente ECL enxugando brevemente, mas não deixe a membrana secar completamente.
   16. Exponha a mancha usando um sistema de imagem de luminescência ou filme de autorradiografia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pFastBac	Invitrogen	Rolamento 10359-016	vetor de baculovírus de dupla expressão
vetor pCR2.1-TOPO	Invitrogen		Vetor do produto do PCR
célula competente E. coli DH5α	Biotecnologia Yeastern	FYE678-80VL	células A competentes de E. coli
E. coli DH10Bac	Invitrogen	Rolamento 10359-016	células B de E. coli competentes
FugeneHD	Roche	4709705001	reagente de transfecção
Opti-MEM	Gibco	31985062	meio de soro reduzido
T4 Ligase	NOVA INGLATERRA BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	Thermo Científico	ER0741
Bluo-gal	Thermo Científico	B1690	substrato de galactosidase
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Meio de Inseto de Grace	Gibco	11605094
Soro fetal bovino	Gibco	10082147
gentamicina	Thermo Fisher	15750060
ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393-25G
canamicina	Sigma-Aldrich	K0254-20ML
gentamicina	Gibco	Rolamento 15710-064
tetraciclina	Sigma-Aldrich	87128-25G
Caldo LB	Merk	1.10285.0500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-5KG
Kcl	Merk	1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136-500G
KH2PO4	J.T.Baker	3246-01
dodecil sulfato de sódio	Merk	1.13760.1000
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	161-0710
TRIS (Base)	J.T.Baker	4109-06
Leite desnatado	Fonterra
Glicerol	J.T.Baker	Nº 2136-01
Tritão X-100	Amresco	0694-1L	detergente A
Pré-adolescente 20	Amresco	0777-500ML	detergente B
Solução de Poloxâmero 188	Sigma-Aldrich	Pág. 5556-100ML	detergente C
Comprimido de coquetel inibidor de protease	Roche	04 693 132 001
3x peptídeo de bandeira	sigma	Rolamento F4799
Contas magnéticas anti-FLAG m2	Sigma-Aldrich	M8823	grânulos magnéticos marcados com anticorpos
Kit SUMOlink SUMO-1	Motivo ativo	Nº 40120	protocolo padrão de SUMOilação
Kit SUMOlink SUMO-2/3	Motivo ativo	Nº 40220	protocolo padrão de SUMOilação
Kit de extração de gel QIAquick	QIAGEN	Rolamento 28704
Mini kit de plasmídeo QIAGEN	QIAGEN	Rolamento 12123	kit de extração de plasmídeo
Tubos de polipropileno	falcão	352059
Placa de Petri	falcão	351029
Elevador de células	Corning	CNG3008
Ponta de carregamento	Sorenson BioCiência	Rolamento 28480
PVDF	PerkinElmer	NEF1002
Papel de filtro absorvente	Bio-Rad	1703932
Mini aparelho de gel de placa (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	Bio-Rad	1658001 EDU
Célula de transferência eletroforética semi-seca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL Western Blotting	Thermo	Rolamento 32106	Reagente ECL
misturador de suspensão	Instrumentos de laboratório Digisystem Inc.	SM-3000
agitador orbital	Kansin instruments Co.	Sistema Operacional 701
ImageQuant LAS 4000	GE Saúde	28955810
gerador de imagens biomolecular	GE Saúde	28955810
Shadow Fiend 9	Thermo Científico	B82501
anticorpo anti-p53	Sinalização Celular	#9282
anticorpo anti-coelho	GE Saúde	NA934-1ML