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1. Preparação do reagente
- Prepare o meio DMEM de baixa fluorescência para ensaios usando um leitor de fluorescência de microplacas. Misture 25 mM de glicose, 0,4 mM de glicina, 0,4 mM de arginina, 0,2 mM de cisteína, 4,0 mM de glutamina, 0,2 mM de histidina, 0,8 mM de isoleucina, 0,8 mM de leucina, 0,8 mM de lisina, 0,2 mM de metionina, 0,4 mM de fenilalanina, 0,4 mM de serina, 0,8 mM de treonina, 0,078 mM de triptofano, 0,4 mM de tirosina, 0,8 mM de valina, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH2PO4. Ajuste o pH da solução usando HCl ou NaOH para pH 7,4. Esterilize o meio através de filtração.
nota: Este meio contém componentes do meio DMEM padrão com glicose alta, exceto que Fe (NO3) 3, vitaminas e vermelho de fenol são omitidos. Vermelho de fenol, riboflavina e piridoxal em meio de cultura DMEM regular interferem significativamente na detecção do sinal de fluorescência. O meio de cultura sem esses componentes é crucial para o sucesso da imagem GFP de células vivas. O meio é estável por 12 meses quando armazenado refrigerado.
2. Ensaio de degradação em tempo real de NLS-luciferase-GFP usando leitor de microplacas de fluorescência
- Semeie aproximadamente 1 x 104 células HeLa em placas pretas de cultura de tecidos de 96 poços com fundo transparente. Após o cultivo de O/N, uma confluência de 50-70% é alcançada no momento da transfecção.
NOTA: 60 μl de meio contendo células HeLa completamente suspensas são semeadas diretamente em cada poço. Não adicione meio adicional ou placa de rocha para frente e para trás após a semeadura, caso contrário, as células podem ser distribuídas de forma desigual.
- Transfecta células HeLa com 0,05-0,1 μg de plasmídeo NLS-luciferase-GFP/pRK5 em cada poço usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Faça uma mistura mestre de transfecção contendo DNA e reagente de transfecção e alicote para cada poço. Três poços com células não são transfectados com DNA, que serve como controle para o sinal de fluorescência de fundo para cada condição de tratamento.
nota: Uma maneira alternativa de reduzir a variação da transfecção é transfectar as células antes da semeadura. No entanto, uma grande parte das células transfectadas com proteínas mal dobradas não consegue se ligar ou mostrar viabilidade reduzida usando este método. É provável que algumas células não suportem o estresse causado pela digestão da tripsina ao expressar proteínas tóxicas mal dobradas. Como resultado, o sinal fluorescente geral é significativamente reduzido.
- 20-24 horas após a transfecção, examine as células vivas sob um microscópio fluorescente invertido para expressão de GFP com comprimento de onda de excitação de 450-490 nm.
- Remova o meio por aspiração a vácuo. Adicione aproximadamente 200 μl 1x PBS a cada poço e, em seguida, aspire-o para remover a quantidade residual de meio DMEM.
- Adicione 60 μl de meio DMEM de baixa fluorescência com 5% de FBS e 50 μg/ml de CHX. Para examinar a degradação proteassoma, inclua o inibidor de proteassoma adicional MG132 (10 μM) em um conjunto de amostras. Definir triplicata de poços para cada tratamento/condição.
nota: O tratamento com MG132 é incluído como controle para a degradação proteassômica porque é crucial descartar outros fatores que podem causar queda do sinal de fluorescência, incluindo morte celular e extinção de fluorescência.
- Meça o sinal de fluorescência de GFP imediatamente em um leitor de placa fluorescente após adicionar CHX.
nota: As configurações de medição do software são mostradas na Tabela 1.
- Leia o prato a cada hora por até 8 a 10 horas. Após a leitura, retorne a placa de volta à incubadora de cultura de células.
- Exporte os dados como arquivo de planilha. Use o valor médio de leituras múltiplas para cada poço e a intensidade de fluorescência. Normalize os valores de cada ponto de dados para os valores médios do Tempo 0 nos respectivos grupos. Plote a intensidade de fluorescência normalizada ao longo do tempo, conforme mostrado na Figura 1A e 1B e na Figura 2, painéis à direita.
- Realizar análise estatística das taxas de degradação entre duas condições usando ANOVA de duas vias com medidas repetidas.
nota: Nesta análise, a "intensidade de fluorescência" é a variável dependente, enquanto "condições de tratamento" e "tempo" são os dois fatores. Em vez de comparar dados em pontos de tempo individuais, a ANOVA de duas vias com medidas repetidas analisa a diferença entre os dois grupos de tratamento ao longo de todo o curso de tempo.
Tabela 1: Configurações de medição no leitor de microplacas de fluorescência.
| Arquivo de definição de placa | GRE96fb |
| Modo de medição | Intensidade de fluorescência inferior |
| Comprimento de onda | Comprimento de onda de excitação | 485 milhas nanômetro |
| Largura de banda de excitação | 9 nm |
| Comprimento de onda de emissão | 535 nm |
| Largura de banda de emissão | 20 nm |
| Número de flashes | 5 |
| Ganho | Manual 200 |
| Tempo de integração | 20 μs |
| Várias leituras por poço | tipo | Círculo (preenchido) |
| tamanho | 5×5 |
| fronteira | 400 μm |
