Ensaio Bioreporter: Uma técnica sensível usando um sistema repórter bioluminescente para detectar anticorpos SARS-CoV-2

Resumo

Fonte: Rezaei, R. et al., Detecção de anticorpo de domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2 usando um Bioreporter baseado em HiBiT. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, mostramos o ensaio baseado no sistema HiBit-RBD bioreporter para detectar anticorpos neutralizantes do SARS-CoV-2. Este sistema tem como alvo o domínio RBD viral usando um sistema repórter bioluminescente contendo HiBiT fundido ao domínio RBD.

Protocolo

1. Detecção de anticorpo anti-RBD com um ensaio rápido e sensível

1. Ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD
   1. Prepare o HiBiT-RBD bioreporter.
      nota: Recomenda-se a utilização do sobrenadante para o ensaio seguinte, uma vez que é mais simples de recolher e contém a versão glicosilada madura da proteína. Além disso, o lisado possui várias outras proteínas que podem interferir na interação HiBiT-RBD-anticorpo.
   2. Combine 50 μL do sobrenadante contendo HiBiT-RBD com 1 μg do anticorpo comercial SARS-CoV-2-RBD em um microtubo de 1,5 mL. Adicione 20 μL de proteína de ligação à imunoglobulina (proteína G) à solução. Aumente o volume total para 300 μL adicionando PBS.
      nota: O volume total da mistura pode ser reduzido para 150 μL. Volumes totais mais baixos não são recomendados, pois podem resultar em mistura inadequada de anticorpos com o biorepórter.
   3. Incubar o(s) tubo(s) num agitador ou rotador de tubos durante 30 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 30 s, eliminar o sobrenadante e lavar com PBS. Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD livre. Ressuspenda em 50 μL de PBS e transfira para uma placa de 96 poços.
   4. Adicione 50 μL de 1x LgBiT e aguarde 5 min. Em seguida, adicione 50 μL de substrato 1x NanoLuc. Leia imediatamente o sinal luminescente com um luminômetro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lavadora magnética portátil Bio-Plex	Bio-Rad	171020100	dispositivo
Sistema de ensaio de luciferase Dual-Glo	Promega	E2940	Kit de 100 mL
LgBiT	Promega	N3030	Kit de ensaio
Pierce Protein G Grânulos Magnéticos	Thermo Fisher Científico	Rolamento 88848	Análise
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo neutralizante de pico, Mab de camundongo	SinoBiológico	40592-MM57	Análise
Leitor de microplacas Synergy Mx	BioTek		Luminômetro de leitor de placas de 96 poços