Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
Uma visão geral esquemática do protocolo de ensaio é fornecida na Figura 1.
1. Preparação inicial
- Para avaliação em ovinos: colete sangue em tubos ativadores de coágulos separadores de soro de 8 mL (consulte a Tabela de Materiais), deixe a amostra de sangue em temperatura ambiente (RT) por 20-30 min e, posteriormente, gire a 2.100 x g por 15 min. O sobrenadante claro que se forma no topo dos tubos é o soro. Alíquota da fase aquosa límpida em tubos de microcentrífuga e armazená-la a -80 °C.
nota: O soro a -80 °C permanece estável por ~5 anos. O sangue foi coletado da veia carótida com agulha 16 G (corte de ponta) e seringa de animais conscientes.
- Aqueça o soro fetal bovino inativado (FBS) colocando-o em banho-maria a 56 ° C por 30 min e agite intermitentemente. Para maior precisão, coloque um termômetro em uma segunda garrafa contendo um volume equivalente de água e adicione-o ao banho de calor ao mesmo tempo que a garrafa FBS. Comece a cronometrar quando o termômetro atingir 56 °C.
- Empregue a técnica asséptica adequada e a prática de cultura de células para todas as etapas subsequentes realizadas na coifa de cultura de células. Pulverize etanol 70% em todos os objetos e no capô antes de usar e limpe com hipoclorito de sódio a 1% após a conclusão.
- Complete o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco combinando DMEM (89%) com alto teor de glicose (4,5 g/L) com FBS inativado por calor (10%) e estreptomicina de penicilina (1%). Combine e filtre usando um sistema de filtração a vácuo estéril (tamanho de poro de 0,22 μm, membrana de polietersulfona) (consulte a Tabela de Materiais). Armazene o DMEM completo embrulhado em papel alumínio a 4 °C.
- Estabelecer as células HT1080 (ver Tabela de Materiais) e passar num balão quadradode 75 cm 2. Crie vários estoques congelados de células. Não use células após 20 passagens, pois a passagem adicional pode influenciar os resultados do ensaio.
2. Dia 1 - Revestimento de células
- Passagem de células HT1080 quando atingem ~ 80% de confluência.
- Pré-aqueça o DMEM completo (preparado na etapa 1.4), 0,05% de tripsina-EDTA e 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C em banho-maria. Remova o meio de crescimento das células passadas usando um sistema de aspiração.
nota: Todas as aspirações neste protocolo usam um sistema de vácuo com um tubo conectado a uma pipeta sorológica estéril de 5 mL.
- Lave as células em 10 mL de PBS 1x pré-aquecido (37 ° C) e tripsinize as células por 3-4 min em 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido para separar as células do frasco.
- Inative a tripsina adicionando 6 mL de DMEM completo pré-aquecido e pipete as células para um tubo de 50 mL. Calcule o número e a concentração de células viáveis usando um hemocitômetro e o método de exclusão de azul de tripano.
- Diluir as células até uma concentração de 1 x 105 células/ml em DMEM completo pré-aquecido. Semeie 100 μL de células/poço em placas transparentes de fundo plano de 96 poços (1 x 10,4 células por poço). Incubar a placa a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) durante a noite durante 16-22 h.
3. Dia 2 - Infectando as células
- Remova a(s) placa(s) da incubadora e use um microscópio óptico para confirmar se as células estão uniformemente dispersas dentro dos poços e se a confluência é de ~ 50%. Se as células não estiverem dentro de uma faixa de confluência de 45% a 55%, repita o protocolo do 'Dia 1' e ajuste a concentração inicial da célula de acordo.
- Gere diluições seriadas das amostras de soro de interesse em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando DMEM completo pré-aquecido como diluente. A Tabela 1 demonstra a geração de uma cascata de diluição para amostras triplicadas.
- Para realizar o ensaio em triplicata, prepare um 7,5 x106 genomas vetoriais (vg) / μL de solução de trabalho de AAV6-hPLAP (ver Tabela de Materiais) diluindo uma solução estoque de vírus em 1x PBS.
- Adicione 66 μL da solução de trabalho do vírus 7,5 x 106 vg/μL a cada tubo contendo 264 μL de diluição do soro/meio (330 μL de volume/diluição total, consulte a Tabela 1).
nota: Este é um ensaio robusto que não requer condições perfeitas de cultura. No entanto, para quantificar com precisão e garantir que cada ensaio seja confiável, é necessário incluir o seguinte: (1) um controle somente de vírus e meio, (2) um controle somente de meio e (3) uma amostra de controle positivo NAb em todas as placas sob as mesmas condições experimentais. O volume descrito (330 μL) é responsável por amostras triplicadas + 10% da mistura de soro e vírus. A realização de réplicas é altamente recomendada para a determinação precisa da atividade neutralizante.
- Misturar as diluições do vírus/soro pipetando e colocar os tubos que contêm as misturas do vírus/soro numa incubadora a 37 °C, CO2 a 5% durante 30 min para permitir a neutralização potencial.
- Pipetar 100 μL da mistura vírus/soro para cada poço na placa de 96 poços contendo 1 x 104 células/poço para cada diluição.
nota: Isso gerará uma concentração viral final de 15k vírus/multiplicidade celular de infecção (MOI) em cada poço. A Tabela 2 fornece um exemplo de layout de placa de amostra de 96 poços para avaliar amostras para uma diluição de 1/512.
- Embrulhe a placa de 96 poços contendo células, soro e AAV-hPLAP em papel alumínio e coloque em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 durante a noite por 16-24 h para permitir a entrada do AAV nas células.
4. Dia 3 - Fixação e adição de substrato às células
- Pré-aqueça uma alíquota de 1x PBS a 37 °C (~ 25 mL / placa de 96 poços). Resfrie alíquotas separadas de PBS (placa de ~ 25 mL / 96 poços) e H2O duplamente destilado (DDW, placa de ~ 25 mL / 96 poços) a 4 ° C. Dissolva um pellet de BCIP / NBT (consulte a Tabela de Materiais) em 10 mL de DDW em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL por vórtice (10 mL é suficiente para 2 placas de 96 poços).
- Aspirar o meio dos poços da placa de 96 poços utilizando uma pipeta serológica ou similar ligada a um sistema de aspiração baseado em sucção ou a um aspirador de hottes. Coloque suavemente a ponta da pipeta sorológica no poço e remova o meio, tomando cuidado para não romper as células aderidas.
- Adicione 50 μL de RT 4% PFA a cada poço usando uma pipeta. Embrulhe a placa em papel alumínio e deixe em RT por 10 min para fixar as células.
cuidado: O paraformaldeído (PFA) é um provável carcinógeno e é tóxico por contato com a pele ou olhos ou inalação. Manuseie uma hotte com equipamento de proteção individual adequado, bem como uma máscara facial. Faça PFA fresco a 4% diluído em PBS (~ 7 mL necessários por placa de 96 poços).
- Lave e aspire as células com 200 μL de RT 1x PBS. Repita esta etapa duas vezes.
nota: Uma pipeta multicanal é uma opção eficiente para as etapas de pipetagem.
- Pipete 200 μL de PBS pré-aquecido em cada poço, envolva a placa em papel alumínio e incube a 65 ° C por 90 min para desnaturar a atividade endógena da fosfatase alcalina.
- Aspirar os poços e lavar as células com 200 μL de PBS frio (4 °C). Aspirar novamente, lavar em 200 μl de DDW frio e aspirar novamente.
- Pipetar 50 μL do BCIP/NBT dissolvido (preparado na etapa 4.1) em cada alvéolo.
- Embrulhe a placa em papel alumínio e incube em RT por 2-24 h.
nota: Ser consistente com o tempo de incubação entre as corridas; A flexibilidade de tempo permite que os usuários fotografem poços no dia 3 ou no dia seguinte.
- Usando uma câmera de microscópio de luz, tire fotos de cada poço usando uma lente objetiva de 4x, garantindo que a mesma exposição, equilíbrio de branco e configurações de luz sejam usadas de forma consistente para todos os ensaios realizados.
- Posicione cada poço de forma idêntica e certifique-se de que as bordas do poço não sejam visíveis nas fotos. Salve fotos no formato TIF ou similar.
nota: As configurações específicas variam entre os microscópios, mas a quantificação será mais eficaz se a iluminação de fundo for alta e consistente em todos os poços (Figura 1B).
Tabela 1: Volumes de soro e diluente necessários para gerar diluições seriadas de soro em triplicata.
| Rótulo em cascata de diluição | diluição | 3 x amostra (240 μL) + 10% do volume tampão (24 μL) | Proporção de soro: mídia |
| Diluição 1 (D1) | 1/2 | 264 μL de soro 264 μL de meio | 50:50 |
| Diluição 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL de mídia | 25:75 |
| Diluição 3 (D3) | 1/8 | Mídia de 264 μL D2 + 264 μL | 12.5:87.5 |
| Diluição 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL de mídia | 6.25:93.75 |
| Diluição 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL de mídia | 3.13:96.87 |
| Diluição 6 (D6) | Faixa 1/64 | 264 μL D5 +264 μL de mídia | 1.56:98.44 |
| Diluição 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL de mídia | 0.78:99.22 |
| Diluição 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL de mídia | 0.39:99.61 |
| Diluição 9 (D9) | Rolamento 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL de mídia | 0.2:99.8 |
| Diluição 10 (D10) | 1/2048 | Mídia D8 de 132 μL + 396 μL | 0.05:99.95 |
| Diluição 11 (D11) | Rolamento 1/8192 | Mídia D9 de 132 μL + 396 μL | 0.01:99.99 |
| Diluição 12 (D12) | Rolamento 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL de mídia | 0.003:99.997 |
Tabela 2: Exemplo de layout de placa de 96 poços para avaliar amostras de soro virgens em diluições que variam de 1/2 a 1/512. Diluições mais altas são incorporadas ao ensaio se avaliar uma amostra sabidamente positiva para AAV NAbs (amostras pós-administração) ou se for necessário um título mais alto. MO (-C): controle somente de mídia. VO (+C): controle somente de vírus e mídia. mAb: Anticorpo monoclonal contra AAV (controle positivo de NAb).
| Amostra de soro #1 | Amostra de soro #2 | Amostra de soro #3 | Mono AB (mAB), controles e amostras extras |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Sample
#1
Rolamento 1/512 | Sample
#1
Rolamento 1/512 | Sample
#1
Rolamento 1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Sample
#2
Rolamento 1/512 | Sample
#2
Rolamento 1/512 | Sample
#2
Rolamento 1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Sample
#3
Rolamento 1/512 | Sample
#3
Rolamento 1/512 | Sample
>#3
Rolamento 1/512 |
