Ensaio de anticorpos neutralizantes AAV baseado em células: uma técnica colorimétrica para detectar anticorpos neutralizantes contra vírus adeno-associados específicos no soro

Resumo

Fonte: Bass-Stringer, S., et al. Um método passo a passo para detectar anticorpos neutralizantes contra AAV usando um ensaio colorimétrico baseado em células. J. Vis. (2021)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio colorimétrico in vitro para detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra vetores do sorotipo 6 do vírus adeno-associado recombinante que expressam fosfatase alcalina (rAAV6) em amostras de soro de ovelhas. O ensaio utiliza a reação entre o AAV que codifica um gene da fosfatase alcalina placentária humana e seu substrato para gerar um produto roxo insolúvel.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

Uma visão geral esquemática do protocolo de ensaio é fornecida na Figura 1.

1. Preparação inicial

1. Para avaliação em ovinos: colete sangue em tubos ativadores de coágulos separadores de soro de 8 mL (consulte a Tabela de Materiais), deixe a amostra de sangue em temperatura ambiente (RT) por 20-30 min e, posteriormente, gire a 2.100 x g por 15 min. O sobrenadante claro que se forma no topo dos tubos é o soro. Alíquota da fase aquosa límpida em tubos de microcentrífuga e armazená-la a -80 °C.
   nota: O soro a -80 °C permanece estável por ~5 anos. O sangue foi coletado da veia carótida com agulha 16 G (corte de ponta) e seringa de animais conscientes.
2. Aqueça o soro fetal bovino inativado (FBS) colocando-o em banho-maria a 56 ° C por 30 min e agite intermitentemente. Para maior precisão, coloque um termômetro em uma segunda garrafa contendo um volume equivalente de água e adicione-o ao banho de calor ao mesmo tempo que a garrafa FBS. Comece a cronometrar quando o termômetro atingir 56 °C.
3. Empregue a técnica asséptica adequada e a prática de cultura de células para todas as etapas subsequentes realizadas na coifa de cultura de células. Pulverize etanol 70% em todos os objetos e no capô antes de usar e limpe com hipoclorito de sódio a 1% após a conclusão.
4. Complete o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco combinando DMEM (89%) com alto teor de glicose (4,5 g/L) com FBS inativado por calor (10%) e estreptomicina de penicilina (1%). Combine e filtre usando um sistema de filtração a vácuo estéril (tamanho de poro de 0,22 μm, membrana de polietersulfona) (consulte a Tabela de Materiais). Armazene o DMEM completo embrulhado em papel alumínio a 4 °C.
5. Estabelecer as células HT1080 (ver Tabela de Materiais) e passar num balão quadrado^{de 75 cm 2}. Crie vários estoques congelados de células. Não use células após 20 passagens, pois a passagem adicional pode influenciar os resultados do ensaio.

2. Dia 1 - Revestimento de células

1. Passagem de células HT1080 quando atingem ~ 80% de confluência.
2. Pré-aqueça o DMEM completo (preparado na etapa 1.4), 0,05% de tripsina-EDTA e 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C em banho-maria. Remova o meio de crescimento das células passadas usando um sistema de aspiração.
   nota: Todas as aspirações neste protocolo usam um sistema de vácuo com um tubo conectado a uma pipeta sorológica estéril de 5 mL.
3. Lave as células em 10 mL de PBS 1x pré-aquecido (37 ° C) e tripsinize as células por 3-4 min em 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido para separar as células do frasco.
4. Inative a tripsina adicionando 6 mL de DMEM completo pré-aquecido e pipete as células para um tubo de 50 mL. Calcule o número e a concentração de células viáveis usando um hemocitômetro e o método de exclusão de azul de tripano.
5. Diluir as células até uma concentração de 1 x 10⁵ células/ml em DMEM completo pré-aquecido. Semeie 100 μL de células/poço em placas transparentes de fundo plano de 96 poços (1 x 10,⁴ células por poço). Incubar a placa a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO₂) durante a noite durante 16-22 h.

3. Dia 2 - Infectando as células

1. Remova a(s) placa(s) da incubadora e use um microscópio óptico para confirmar se as células estão uniformemente dispersas dentro dos poços e se a confluência é de ~ 50%. Se as células não estiverem dentro de uma faixa de confluência de 45% a 55%, repita o protocolo do 'Dia 1' e ajuste a concentração inicial da célula de acordo.
2. Gere diluições seriadas das amostras de soro de interesse em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando DMEM completo pré-aquecido como diluente. A Tabela 1 demonstra a geração de uma cascata de diluição para amostras triplicadas.
   1. Para realizar o ensaio em triplicata, prepare um 7,5 x10⁶ genomas vetoriais (vg) / μL de solução de trabalho de AAV6-hPLAP (ver Tabela de Materiais) diluindo uma solução estoque de vírus em 1x PBS.
   2. Adicione 66 μL da solução de trabalho do vírus 7,5 x 10⁶ vg/μL a cada tubo contendo 264 μL de diluição do soro/meio (330 μL de volume/diluição total, consulte a Tabela 1).
      nota: Este é um ensaio robusto que não requer condições perfeitas de cultura. No entanto, para quantificar com precisão e garantir que cada ensaio seja confiável, é necessário incluir o seguinte: (1) um controle somente de vírus e meio, (2) um controle somente de meio e (3) uma amostra de controle positivo NAb em todas as placas sob as mesmas condições experimentais. O volume descrito (330 μL) é responsável por amostras triplicadas + 10% da mistura de soro e vírus. A realização de réplicas é altamente recomendada para a determinação precisa da atividade neutralizante.
3. Misturar as diluições do vírus/soro pipetando e colocar os tubos que contêm as misturas do vírus/soro numa incubadora a 37 °C, CO₂ a 5% durante 30 min para permitir a neutralização potencial.
4. Pipetar 100 μL da mistura vírus/soro para cada poço na placa de 96 poços contendo 1 x 10⁴ células/poço para cada diluição.
   nota: Isso gerará uma concentração viral final de 15k vírus/multiplicidade celular de infecção (MOI) em cada poço. A Tabela 2 fornece um exemplo de layout de placa de amostra de 96 poços para avaliar amostras para uma diluição de 1/512.
5. Embrulhe a placa de 96 poços contendo células, soro e AAV-hPLAP em papel alumínio e coloque em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO₂ durante a noite por 16-24 h para permitir a entrada do AAV nas células.

4. Dia 3 - Fixação e adição de substrato às células

1. Pré-aqueça uma alíquota de 1x PBS a 37 °C (~ 25 mL / placa de 96 poços). Resfrie alíquotas separadas de PBS (placa de ~ 25 mL / 96 poços) e H₂O duplamente destilado (DDW, placa de ~ 25 mL / 96 poços) a 4 ° C. Dissolva um pellet de BCIP / NBT (consulte a Tabela de Materiais) em 10 mL de DDW em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL por vórtice (10 mL é suficiente para 2 placas de 96 poços).
2. Aspirar o meio dos poços da placa de 96 poços utilizando uma pipeta serológica ou similar ligada a um sistema de aspiração baseado em sucção ou a um aspirador de hottes. Coloque suavemente a ponta da pipeta sorológica no poço e remova o meio, tomando cuidado para não romper as células aderidas.
   1. Adicione 50 μL de RT 4% PFA a cada poço usando uma pipeta. Embrulhe a placa em papel alumínio e deixe em RT por 10 min para fixar as células.
      cuidado: O paraformaldeído (PFA) é um provável carcinógeno e é tóxico por contato com a pele ou olhos ou inalação. Manuseie uma hotte com equipamento de proteção individual adequado, bem como uma máscara facial. Faça PFA fresco a 4% diluído em PBS (~ 7 mL necessários por placa de 96 poços).
3. Lave e aspire as células com 200 μL de RT 1x PBS. Repita esta etapa duas vezes.
   nota: Uma pipeta multicanal é uma opção eficiente para as etapas de pipetagem.
4. Pipete 200 μL de PBS pré-aquecido em cada poço, envolva a placa em papel alumínio e incube a 65 ° C por 90 min para desnaturar a atividade endógena da fosfatase alcalina.
5. Aspirar os poços e lavar as células com 200 μL de PBS frio (4 °C). Aspirar novamente, lavar em 200 μl de DDW frio e aspirar novamente.
6. Pipetar 50 μL do BCIP/NBT dissolvido (preparado na etapa 4.1) em cada alvéolo.
7. Embrulhe a placa em papel alumínio e incube em RT por 2-24 h.
   nota: Ser consistente com o tempo de incubação entre as corridas; A flexibilidade de tempo permite que os usuários fotografem poços no dia 3 ou no dia seguinte.
8. Usando uma câmera de microscópio de luz, tire fotos de cada poço usando uma lente objetiva de 4x, garantindo que a mesma exposição, equilíbrio de branco e configurações de luz sejam usadas de forma consistente para todos os ensaios realizados.
   1. Posicione cada poço de forma idêntica e certifique-se de que as bordas do poço não sejam visíveis nas fotos. Salve fotos no formato TIF ou similar.
      nota: As configurações específicas variam entre os microscópios, mas a quantificação será mais eficaz se a iluminação de fundo for alta e consistente em todos os poços (Figura 1B).

Tabela 1: Volumes de soro e diluente necessários para gerar diluições seriadas de soro em triplicata.

Rótulo em cascata de diluição	diluição	3 x amostra (240 μL) + 10% do volume tampão (24 μL)	Proporção de soro: mídia
Diluição 1 (D1)	1/2	264 μL de soro 264 μL de meio	50:50
Diluição 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL de mídia	25:75
Diluição 3 (D3)	1/8	Mídia de 264 μL D2 + 264 μL	12.5:87.5
Diluição 4 (D4)	1/16	264 μL D3 +264 μL de mídia	6.25:93.75
Diluição 5 (D5)	1/32	264 μL D4 +264 μL de mídia	3.13:96.87
Diluição 6 (D6)	Faixa 1/64	264 μL D5 +264 μL de mídia	1.56:98.44
Diluição 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL de mídia	0.78:99.22
Diluição 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL de mídia	0.39:99.61
Diluição 9 (D9)	Rolamento 1/512	264 μL D7 + 264 μL de mídia	0.2:99.8
Diluição 10 (D10)	1/2048	Mídia D8 de 132 μL + 396 μL	0.05:99.95
Diluição 11 (D11)	Rolamento 1/8192	Mídia D9 de 132 μL + 396 μL	0.01:99.99
Diluição 12 (D12)	Rolamento 1/32768	132 μL D10 + 396 μL de mídia	0.003:99.997

Tabela 2: Exemplo de layout de placa de 96 poços para avaliar amostras de soro virgens em diluições que variam de 1/2 a 1/512. Diluições mais altas são incorporadas ao ensaio se avaliar uma amostra sabidamente positiva para AAV NAbs (amostras pós-administração) ou se for necessário um título mais alto. MO (-C): controle somente de mídia. VO (+C): controle somente de vírus e mídia. mAb: Anticorpo monoclonal contra AAV (controle positivo de NAb).

Amostra de soro #1

Amostra de soro #2

Amostra de soro #3

Mono AB (mAB), controles e amostras extras

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng Mab

50 ng Mab

50 ng Mab

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng Mab

5 ng Mab

5 ng Mab

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng Mab

0.5 ng Mab

0.5 ng Mab

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

Sample #1 Rolamento 1/512

Sample #1 Rolamento 1/512

Sample #1 Rolamento 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

Sample #2 Rolamento 1/512

Sample #2 Rolamento 1/512

Sample #2 Rolamento 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

Sample #3 Rolamento 1/512

Sample #3 Rolamento 1/512

Sample >#3 Rolamento 1/512

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático do protocolo de ensaio NAb. (A) Representação visual do ensaio NAb ilustrando as principais etapas envolvidas no protocolo de três dias. Resumidamente, as células são cultivadas e banhadas durante a noite. No dia seguinte, diluições seriadas de soro são preparadas, incubadas com AAV e, em seguida, incubadas com as células durante a noite. No dia seguinte, as células são...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% de tripsina / EDTA	Gibco	Rolamento 25300-054
Tubo de centrífuga cônico de 50 mL	falcão	Telefone: 14-432-22	Ou equivalente
75 cm2 frascos quadrados	falcão	353136	Ou equivalente
Placa de fundo plano de 96 poços	falcão	353072
Vetor AAV6-CMV-hPLAP			Laboratório de Pesquisa e Terapêutica Muscular (Universidade de Melbourne, Austrália) AAV6-CMV-hPLAP pode ser fornecido mediante solicitação.
papel-alumínio
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AAV6 (partícula intacta) (ADK6)	PROGEN	610159	Anticorpo monoclonal de controle positivo
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
Armário de segurança para cultura de células e tecidos
Pipeta Eletrônica			Inserções de stripette de 5 & 10 mL
Soro fetal bovino	Gibco	Rolamento 10099-141
Hemocitômetro
Meio de Águia Modificado de Dulbecco com alta glicose (DMEM)	Gibco	11965118
Células HT1080	ATCC
incubadora			37 °C, 5% CO2
Microscópio óptico com câmera			Capaz de tirar fotos com uma lente objetiva 4x
forno			Para uma incubação a 65 °C
Paraformaldeído	Merck	Rolamento 30525-89-4
Banho-maria
Penicilina estreptomicina	Gibco	15140-122