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1. Preparação do meio de cultura, da solução de ofloxacina e das células de E. coli
- Meio Luria-Bertani (LB) regular: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura em água deionizada (DI). Esterilize o meio em autoclavagem.
- Placas de ágar LB: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 15 g/L de ágar em água DI e esterilize o meio em autoclavagem. Na temperatura desejada (~ 55 ° C), despeje ~ 30 mL de meio ágar em pratos quadrados (10 x 10 cm). Seque as placas e guarde-as a 4 °C.
- Meio LB modificado: Adicionar 10 g/L de triptona e 5 g/L de extrato de levedura em água DI. Esterilize o meio em autoclavagem.
- Meio LB modificado incluindo um osmólito: Misture 2x meio LB modificado com uma solução de 2x osmólito em volumes iguais. Para preparar 2x meio LB modificado, adicione 20 g/L de triptona e 10 g/L de extrato de levedura em água DI e esterilize em autoclavagem. Para preparar a solução de osmólito 2x, dissolva o osmólito de interesse (quantidade 2x) em água DI e, em seguida, esterilize a solução por filtro.
nota: O osmólito de interesse e suas concentrações podem ser determinados a partir dos ensaios de triagem de microarranjo de fenótipo (ver Protocolo 4). No entanto, o osmólito testado e a concentração 2x associada podem ser ajustados dependendo da natureza da pesquisa. Por exemplo, para estudar o impacto do cloreto de sódio 1 mM, uma solução de osmólito 2x seria uma solução de cloreto de sódio 2 mM.
- Solução estoque de ofloxacina (5 mg / mL): Adicione 5 mg de sal de ofloxacina (OFXACINA) em 1 mL de água DI. Adicione 10 μL de hidróxido de sódio 10 M para aumentar a solubilidade do OFX em água e, em seguida, esterilize a solução por filtro. Preparar alíquotas e conservar a -20 °C.
nota: A ofloxacina é um antibiótico quinolona que tem sido amplamente utilizado tanto para células bacterianas em crescimento quanto em não crescimento14,21. A concentração inibitória mínima (CIM) de OFX para células E. coli MG1655 está dentro da faixa de 0,039–0,078 μg/mL. Além disso, observe que outros antibióticos, como ampicilina e canamicina, são comumente usados em pesquisas persistentes. A escolha dos antibióticos depende da natureza do estudo.
- Estoques de células de E. coli MG1655: Inocular 2 mL de meio LB regular com uma única colônia em um tubo de ensaio de 14 mL (com tampa de encaixe) e cultivar as células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 ° C. Quando as células atingirem a fase estacionária, misture 500 μL da cultura de células com 500 μL de glicerol a 50% (estéril) em um frasco criogênico e armazene a -80 °C.
2. Propagação de células para eliminar persistentes pré-existentes
- Para preparar uma cultura durante a noite, raspe uma pequena quantidade de células de um estoque de células congeladas com uma ponta de pipeta estéril (não descongele o estoque de células de glicerol) e inocule as células em 2 mL de meio LB modificado em um tubo de ensaio de 14 mL com tampa de pressão. Cultivar as células num agitador orbital a 250 rpm e a 37 °C durante 12 h.
- Primeira propagação
- Após 12 h, transferir 250 μL de cultura durante a noite para 25 ml de meio LB modificado fresco num balão defletor de 250 ml coberto com folha de alumínio estéril.
- Cultivar a cultura de células num agitador orbital a 250 rpm e a 37 °C até que as células atinjam a fase exponencial média (OD600 = 0,5).
- Meça a densidade óptica a 600 nm (OD600) usando um leitor de microplacas a cada 30 min.
- Segunda propagação
- Em OD600 = 0,5, diluir 250 μL de cultura de células do primeiro frasco em 25 ml de meio LB modificado fresco num balão defletor de 250 ml.
- Cultive a segunda cultura de células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 ° C até OD600 = 0,5.
- Meça a densidade óptica a cada 30 min.
nota: Uma cultura noturna pode ter uma quantidade significativa de células persistentes. O método de diluição/ciclo de crescimento descrito acima pode ser usado para eliminar esses persistentes pré-existentes antes de transferir as células para microarrays. Sua eliminação pode ser validada quantificando os níveis persistentes de culturas durante a noite com o ensaio descrito no Protocolo 3.
3. Validando a eliminação de células persistentes pré-existentes
- Após a segunda propagação (ver passo 2.3), diluir 250 μL da cultura celular (OD600 = 0,5) em 25 ml de meio LB modificado fresco num balão defletor de 250 ml.
nota: Para controles, diluir 250 μL de cultura durante a noite (ver etapa 2.1) em 25 mL de meio LB modificado fresco em um balão defletor de 250 mL. Antes de transferir as células para o frasco, a densidade celular da cultura noturna deve ser ajustada num meio LB modificado fresco para obter OD600 = 0,5.
- Adicionar 25 μL de solução-mãe OFX (5 mg/ml) à suspensão celular e agitar suavemente o balão para tornar a cultura do ensaio homogénea. A concentração final de OFX é de 5 μg/mL na cultura do ensaio.
- Incubar a cultura do ensaio num agitador orbital a 250 rpm e a 37 °C.
- A cada hora durante o tratamento (incluindo 0 h, o ponto de tempo antes de adicionar OFX à cultura do ensaio), transfira 1 mL da cultura do ensaio do frasco para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugue a cultura de ensaio no tubo de microcentrífuga a 17.000 x g por 3 min.
- Remova cuidadosamente 950 μL do sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
- Adicione 950 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no tubo da microcentrífuga.
- Repita as etapas de lavagem 3,5-3,7 por 3x no total até que a concentração do antibiótico esteja abaixo da concentração inibitória mínima (CIM).
- Após a lavagem final, ressuspenda o pellet celular em 100 μL de solução de PBS, resultando em uma amostra concentrada de 10x.
- Pegue 10 μL da suspensão celular e dilua-a em série seis vezes em 90 μL de solução PBS usando uma placa inferior redonda de 96 poços.
- Localize 10 μL de suspensões de células diluídas em placas de ágar fresco sem antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, coloque os 90 μL restantes da suspensão celular em uma placa de ágar fresco.
- Incubar as placas de ágar-ágar a 37 °C durante 16 h e contar em seguida as unidades formadoras de colónias (UFC). Considere as taxas de diluição ao calcular o número total de UFC em 1 mL de cultura de ensaio. As curvas de morte são geradas plotando os valores logarítmicos de UFC em relação à duração do tratamento com antibióticos.
nota: Um tratamento OFX de 6 h é suficiente para obter uma curva de morte bifásica para células de E. coli. O nível persistente de células propagadas (medido pela contagem de UFC em 6 h) deve ser significativamente menor do que o da cultura noturna. Os procedimentos descritos nos Protocolos 2 e 3 podem ser realizados com LB regular, dependendo do desenho da pesquisa.
4. Rastreios de placas de microarray
- Preparação de culturas de células de microarray
- Transfira 250 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão celular para torná-la homogênea.
nota: As células de fase exponencial (OD600 = 0,5) são obtidas a partir da segunda etapa de propagação (ver etapa 2.3).
- Transfira a suspensão celular diluída para um reservatório estéril de 50 mL.
- Usando uma pipeta multicanal, transfira 150 μL da suspensão celular para cada poço de um microarray, ou seja, uma placa de 96 poços contendo vários osmólitos.
nota: Poços que não possuem osmólitos servem como controles.
- Cubra o microarray com uma membrana de vedação permeável a gás.
- Incubar a placa num agitador orbital a 37 °C e 250 rpm durante 24 h.
nota: Nesses experimentos, foram utilizadas placas disponíveis comercialmente, como Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) que incluem uma ampla gama de osmólitos, tampões de pH e outros produtos químicos em estado seco em várias concentrações. Esses microarrays estão em formatos de placa de 96 poços de meia área. Os volumes de cultura devem ser ajustados dependendo do tipo de placas utilizadas. Microarrays também podem ser gerados manualmente.
- Preparação manual de placas de microarray
- Transfira 75 μL de soluções de osmólito 2x para os poços de uma placa de 96 poços de meia área.
- Transfira 500 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado 2x em um tubo de centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão celular para torná-la homogênea.
nota: A taxa de inoculação foi ajustada para ser consistente com o protocolo de triagem de microarray descrito em 4.1.
- Adicione 75 μL da suspensão celular em cada poço da placa de 96 poços de meia área contendo 2x soluções de osmólito.
- Incubar a placa num agitador orbital a 37 °C e 250 rpm durante 24 h.
- Preparando placas de ensaio persistentes
- Preparar 25 ml de meio LB modificado contendo 5 μg/ml de OFX num tubo de centrifugação de 50 ml e transferir este meio para um reservatório estéril.
- Transfira 190 μL de meio LB modificado com OFX do reservatório para cada poço de uma placa genérica de fundo plano de 96 poços (placa de ensaio persistente) usando uma pipeta multicanal.
- Remova o microarray do agitador (após cultura por 24 h) e transfira 10 μL de culturas de células do microarray para os poços da placa de ensaio persistente, contendo meio LB modificado com OFX.
- Pegue 10 μL de suspensões celulares da placa de ensaio persistente e dilua em série três vezes em 290 μL de solução PBS usando uma placa de fundo redondo de 96 poços e uma pipeta multicanal.
- Após a diluição em série, localize 10 μL de todas as suspensões de células diluídas em série em placas de ágar fresco sem antibióticos usando uma pipeta multicanal.
- Incubar a placa de ensaio persistente (preparada na etapa 4.3.3) em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 6 h após cobrir a placa com uma membrana de vedação permeável a gás.
- Após 6 h de incubação num agitador, retirar a placa de ensaio persistente e repetir os passos 4.3.4-4.3.5.
- Incubar as placas de ágar durante 16 h a 37 °C e, em seguida, contar as UFC. Os níveis de UFC antes e 6 h após o tratamento com antibióticos permitem calcular a fração persistente em cada poço. As contagens de UFC antes do tratamento com OFX também ajudam a avaliar os efeitos dos osmólitos e na viabilidade de E. coli.