1. Medindo o declínio da proteostase no tecido muscular usando animais que expressam poliglutamina
NOTA: Dois métodos podem ser usados para identificar o declínio da proteostase nas células musculares: imagem da formação de agregados de proteínas durante o envelhecimento (1.1) e medição da proteotoxicidade que esses agregados causam com a idade até o início da paralisia (1.2).
- Imagem da formação de agregados de poliglutamina no músculo durante o envelhecimento
nota: A progressão dependente da idade da agregação de proteínas nas células musculares é visualizada usando repetições de poliglutamina (polyQ) fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este protocolo descreve o uso da cepa AM140 rmIs132 [unc-54p :: Q35 :: YFP], mas outras cepas variantes de poliglutamina também podem ser usadas. O transgene polyQ::YFP é expresso no músculo usando o promotor específico do músculo unc-54. Animais sincronizados que expressam unc-54p::p olyQ::YFP são visualizados nos dias 1, 2, 3 e 4 da idade adulta. Para visualizar agregados unc-54p::p olyQ::YFP, use um microscópio composto equipado para fluorescência ou um microscópio de dissecação fluorescente. O AM140 está disponível no Caenorhabditis Genetics Center (CGC) em: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- Nos dias de imagem (dia 1, 2, 3 e 4 da idade adulta), escolha 20 animais e monte-os em uma configuração de lâmina de microscópio com uma almofada de agarose a 3% e uma gota de 5 μL de azida sódica 10 mM (diluída em tampão M9).
- Depois que todos os animais forem imobilizados por azida sódica (~ 5 minutos), faça uma imagem de todo o corpo dos animais usando uma lente de ampliação de 10x (Figura 1A). Para imagens, use um filtro FITC e a mesma exposição para todos os animais. Descarte as lâminas após a imagem.
nota: Alternativamente, os focos YFP também podem ser quantificados diretamente nas placas, mas o movimento deve ser inibido pela aplicação de um fluxo de dióxido de carbono na placa durante a pontuação. Este método alternativo é mais apropriado ao rastrear um grande número de condições.
- Após a aquisição das imagens, conte o número de focos nos músculos da parede corporal de todo o animal. Os focos são sinais pontuados mais brilhantes que podem ser diferenciados do sinal solúvel do dimmer em segundo plano.
- Trace a progressão do acúmulo de focos YFP dos dias 1, 2, 3 e 4. Plote um gráfico XY onde X representa os dias da idade adulta e Y representa o número de focos unc-54p::p olyQ::YFP (Figura 1B). O número de focos na condição experimental (por exemplo, regulação negativa ou superexpressão de genes) é comparado aos animais de controle. Realize análises estatísticas entre os grupos em cada ponto de tempo observado para cada tentativa.
- Ao comparar a contagem de focos para apenas duas condições, execute um teste t de amostra independente em cada ponto de tempo.
- Ao comparar a contagem de focos para mais de duas condições, execute uma análise ANOVA unidirecional geral para cada ponto de tempo, incluindo os dados de todas as condições naquele ponto de tempo. Se a ANOVA omnibus produzir um valor-p significativo (ou seja, p < 0,005), realize uma análise post-hoc com testes t de amostra independentes pareados para determinar as condições específicas entre as quais uma diferença significativa nos focos foi detectada (por exemplo, para os grupos A, B e C, compare A e B, A e C e B e C).
2. Medição das taxas de paralisia animal como substituto da toxicidade da poliglutamina em células musculares
NOTA: O aumento dependente da idade de agregados poliQ no músculo causa o declínio da função muscular que impulsiona a locomoção. Esse defeito na locomoção pode ser determinado medindo a taxa progressiva de paralisia em animais que expressam poliQ. Para o ensaio de paralisia, os animais que expressam unc-54p::p olyQ::YFP sincronizados são pontuados nos dias 3, 5, 7 e 9 da idade adulta. Adicione pontos de tempo adicionais conforme necessário, para estender a faixa de pontuação de modo que o efeito da perturbação genética possa ser avaliado.
- Nos dias de pontuação (dia 3, 5, 7 e 9 da idade adulta), observe as placas de 6 cm contendo 50 animais e registre o número de animais paralisados. Remova os animais paralisados do prato. Se os animais rastejaram para fora do prato ou morreram, eles devem ser censurados; Registre o evento para que ele possa ser contabilizado na análise.
nota: Um animal é considerado paralisado quando nenhum movimento é observado após expô-lo a estímulos leves ou de toque suave. A atividade de bombeamento faríngeo é usada para determinar se os animais imóveis estão vivos ou mortos.
- Ao final do experimento, calcule a taxa de paralisia para cada condição. Faça isso em cada ponto de tempo dividindo a fração de animais paralisados pelo número total de animais observados para essa condição. Se observar várias placas por condição por ponto de tempo (ou seja, placas replicadas), calcule a proporção separadamente para cada replicação.
- Plote a progressão da taxa de paralisia em um gráfico XY (gráfico de dispersão). X representa os dias da idade adulta e Y representa as taxas de paralisia. A taxa de paralisia de animais unc-54p::p olyQ::YFP é comparada com animais de controle (Figura 1C). Realizar análises estatísticas entre os grupos; Para vários ensaios, trate os ensaios de forma independente. Use a Regressão de Riscos Proporcionais de Cox e o teste de Wald. A maioria das ferramentas de análise de dados que suportam a análise de sobrevivência também suportam a modelagem de Cox.
- Transforme os dados: cada condição deve ter duas colunas, uma para tempo e outra para "evento". Em cada ponto de tempo observado, adicione uma linha com "0" para cada animal paralisado e um "1" para cada animal censurado. O número total de linhas deve ser igual ao número de animais que iniciam na placa para essa condição.
- Realizar a modelagem de riscos proporcionais de Cox, seguida do teste de Wald, de acordo com as instruções do software estatístico. Um modelo univariado será apropriado para projetos de experimentos típicos. Para mais de duas condições, se um teste com todas as condições incluídas indicar um resultado significativo (ou seja, p < 0,005), testes em pares entre condições podem ser realizados para determinar o(s) par(es) significativo(s) específico(s) de condições.
nota: O modelo de Cox baseia-se na suposição de que a(s) condição(ões) de teste modula(m) a probabilidade de um evento proporcionalmente ao longo do tempo. Isso significa, por exemplo, que o modelo de Cox não seria apropriado para comparar uma condição sob a qual a maioria dos animais está paralisada no dia 1 com uma condição sob a qual a maioria dos animais está paralisada no dia 9. Extensões do modelo de Cox e outras abordagens para comparar proporções paralisadas em cada ponto de tempo estão disponíveis para casos em que a suposição de riscos proporcionais não se sustenta.
