Ensaio de co-incubação bacteriana: uma técnica baseada em microscopia de fluorescência para visualizar a competição bacteriana intraespecífica no nível de célula única

Resumo

Fonte: Smith, S., et al., Quantificação da Competição Interbacteriana usando Imagens de Fluorescência de Célula Única. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um método baseado em microscopia de fluorescência para estudar a competição bacteriana no nível de uma única célula. Este método fornece informações sobre a estrutura e função das comunidades bacterianas.

Protocolo

1. Cepas bacterianas Coincubate

1. Escolha duas cepas bacterianas para ensaios de competição bacteriana de célula única. Aqui, duas cepas de V. fischeri são usadas: uma cepa alvo (ES11424) e uma cepa inibidora (MJ1125) que é conhecida por matar a cepa alvo usando o sistema de secreção tipo VI no cromossomo II (T6SS2)1, que é um mecanismo de morte dependente de contato.
2. Transforme cepas com plasmídeos estáveis que codificam genes para diferentes proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou RFP) para distinguir visualmente os tipos de cepas no microscópio. Aqui, a cepa inibidora é marcada com um plasmídeo codificador de GFP (pVSV102) e a cepa alvo é marcada com um plasmídeo codificador de dsRed (pVSV208).
3. Comece com culturas mid-log para ambas as cepas, meça e registre a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) para todas as amostras.
4. Normalize cada amostra para um OD₆₀₀ = 1,0, o que corresponde a aproximadamente 10⁹ UFC/mL para V. fischeri, diluindo a cultura com meio LBS.
5. Misture as duas cepas concorrentes em uma proporção de 1:1 com base no volume, adicionando 30 μL de cada cepa normalizada a um tubo rotulado de 1,5 mL. Vórtice a cultura de cepas mistas por 1-2 s.
   nota: Em alguns casos, pode ser apropriado misturar coculturas em proporções diferentes. Por exemplo, quando uma cepa cresce muito mais rápido que a outra, pode ser necessário iniciar a cepa de crescimento mais lento com uma vantagem numérica para observar a competição. A otimização também pode ser necessária se o OD₆₀₀ não corresponder a UFC/mL semelhante para ambas as cepas.
6. Repita a etapa 1.5 para cada réplica biológica e tratamento. No exemplo mostrado aqui, isso resultará em um total de quatro tubos de cepas mistas: duas réplicas biológicas com a cepa inibidora do tipo selvagem misturada com a cepa alvo e duas réplicas biológicas com a cepa mutante do sistema de secreção tipo VI misturada com a cepa alvo.
7. Para garantir que as células concorrentes sejam suficientemente densas para serem mortas dependentes de contato na coincubação na almofada de ágar, concentre cada cultura mista 3 vezes centrifugando a cultura mista em um tubo de centrífuga padrão de 1,5 mL por 1 min a 21.130 x g, descartando o sobrenadante e ressuspendendo cada pellet em meio de 20 μL LBS. Repita para cada amostra.
   nota: Algumas células bacterianas são sensíveis a danos por centrifugação em alta rcf; Nesses casos, a cultura mista pode ser centrifugada por 3 min a 4600 x g. Além disso, ao quantificar a competição dependente do contato, é importante garantir densidade celular suficiente na lâmina para observar a morte. Neste artigo, os tratamentos "lotados", onde a morte é observada, tinham aproximadamente 10 células/20 μm².

2. Configuração do slide

1. Ao usar um microscópio vertical, coloque uma almofada de agarose² de ~5 mm em uma lâmina de vidro padrão de 1 mm. Localize 2 μL de uma cultura mista na almofada de agarose e coloque uma lamínula # 1,5 (25 mm²) sobre a mancha. Veja a Figura 1B.
2. Ao usar um microscópio invertido, coloque 2 μL de uma cultura mista no fundo da lamínula # 1,5 de uma placa de Petri de 35 mm e coloque uma almofada de agarose^{de ~} 5 mm 2 sobre o local de coincubação. Coloque uma lamínula de vidro circular de 12 mm sobre a almofada de agarose. Consulte a Figura 1C para obter um exemplo.
3. Repita as etapas 2.1 ou 2.2, dependendo da configuração do microscópio usada, para as três culturas mistas restantes, resultando em quatro lâminas ou pratos a serem visualizados.
4. Deixe os slides assentarem na bancada por aproximadamente 5 minutos antes de prosseguir. Isso permite que as células se acomodem na almofada de ágar e eliminem o movimento durante o processo de imagem.

3. Microscopia de fluorescência

1. Comece focando nas células usando luz branca (contraste de fase ou DIC) para minimizar os efeitos do fotobranqueamento. Com base no tamanho médio de uma única célula bacteriana, use uma objetiva de óleo de 60x ou 100x.
2. Ajuste o tempo de exposição e as configurações de aquisição para cada canal para que as células fiquem visíveis no canal apropriado com detecção mínima de fundo.
   nota: É adequado utilizar tempos de exposição diferentes para canais diferentes, mas deve ser utilizado o mesmo tempo de exposição em todos os replicados biológicos e tratamentos para um determinado canal.
3. Para cada amostra, selecione pelo menos cinco campos de visão (FOV) e adquira imagens em cada canal apropriado usando as configurações de aquisição (veja exemplos na Figura 2). Salve os pontos XY de cada FOV para que o mesmo FOV possa ser visualizado durante o ponto de tempo final. A imagem do mesmo FOV em cada ponto de tempo é necessária para determinar a proporção da área ocupada por células-alvo ou inibidoras durante as etapas de análise.
   nota: Neste exemplo, a fluorescência de GFP é detectada usando um filtro com um comprimento de onda de excitação de 467 - 498 nm e um filtro de emissão de 513 - 556 nm e é de cor verde falsa. A fluorescência do dsRed é detectada usando um filtro com um comprimento de onda de excitação de 542 - 582 nm e um filtro de emissão de 603 - 678 nm e é magenta de cor falsa.
4. Após 2 h, repita a etapa acima para cada amostra usando os pontos XY salvos anteriormente (Figura 2).
   nota: O tempo das imagens subsequentes pode precisar ser otimizado para organismos com diferentes taxas de crescimento ou mecanismos competitivos.

Resultados

Figura 1: Preparação da almofada de agarose e configuração da lâmina para ensaios de coincubação. (A) Configuração para fazer almofadas de agarose a 2%. Cinco camadas de fita adesiva (verde) são enroladas em torno de uma lamínula em dois pontos separados por aproximadamente 20 mm. Em seguida, agarose quente a 2% em solução salina tamponada com fosfato marinho (amarelo) é pipetada ent...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	pescador	05-408-129
Pipeta monocanal de 10 uL
Pipeta monocanal de 1000 uL
Pipeta monocanal de 20 uL
Pipeta monocanal de 200 uL
agarose	pescador	BP165-25	Baixo ponto de fusão de agarose
Prato Cellvis 35 mm	pescador	NC0409658	#1.5 fundo de vidro de cobertura
cloranfenicol	sigma	C0378	estoque (20 mg/mL em etanol); concentração final em meio (2 μg/mL LBS)
Software de análise de imagem FIJI	ImagemJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Software de código aberto
Copos de cobertura Fisherbrand: Círculos	pescador	12-545-81P	#1.5 vidro de cobertura; 12 mm de diâmetro
Sulfato de canamicina	pescador	BP906-5	estoque (100 mg/mL em água, esterilização por filtro); concentração final em meio (1 μg/mL LBS)
Papel de seda de limpeza de lentes	pescador	S24530
Placas de Petri	pescador	FB0875713	estéril com tampa
Lâminas	pescador	S65921
Cuvetes semimicro	VWR	97000-586
espectrofotômetro
Lâminas de Microscópio Simples com Selo Dourado da Thermo Scientific	pescador	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Tampa de Vidro	pescador	22-050-235	#1.5 Vidro de cobertura, 25 mm2
Óleo de imersão tipo F	pescador	NC0297589
Microscópio de fluorescência vertical ou invertido com câmera e software de imagem			As imagens deste artigo foram adquiridas em um microscópio fluorescente invertido Nikon TI-2 equipado com uma câmera CMOS digital ORCA-Fusion usando o software NIS-Elements.
vórtice
Banho-maria			Usado para manter a agarose quente antes da pipetagem
Mídia LBS
Tampão Tris 1M (pH ~ 7,5)			50 mL de tampão de estoque 1 M (62 mL de HCl, 938 mL de água DI, 121 g de Base Trizma)
Ágar Técnico	pescador	DF0812-17-9	15 g (Adicionar apenas para pratos)
Água DI			950 mL
cloreto de sódio	pescador	S640-3	20 gramas
Triptona	pescador	BP97265	10 gramas
Extrato de levedura	pescador	BP9727-2	5 g
mPBS (PBS marinho)			Solução salina tamponada com fosfato com sais marinhos adicionados; usado para fazer almofada de agarose
10X PBS	pescador	ICN1960454
Sal marinho oceano instantâneo	Oceano instantâneo	SS1-160P	Ajuste a concentração para a salinidade apropriada; 20 psu usados aqui
Unidades de filtro a vácuo estéreis	pescador	SCGVU01RE	Usado para filtrar-esterilizar mPBS
Bomba de vácuo			Usado para filtrar-esterilizar mPBS