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Artigo de método
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8 de julho de 2025
Fonte: Wang, L. et al., Estudos de interações chaperona-chaperona usando ensaio homogêneo baseado em contas. J. Vis. Exp. (2021)
Neste vídeo, demonstramos o ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado - um ensaio de proximidade baseado em esferas. Ele utiliza grânulos aceptores e doadores de tamanho homogêneo, imobilizados com duas proteínas que tendem a interagir para rastrear pequenas moléculas potenciais que inibem as interações proteicas.
NOTA: Uma visão geral deste protocolo é mostrada na Figura 1.
1. Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 1A)
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Figura 1: Esquema deste protocolo. (A) Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Acoplamento do peptídeo C-terminal Hsp90 às esferas receptoras. (C) O ensaio que investiga a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e o peptídeo C-terminal Hsp90. Inibição com compostos de pequena massa molecular.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 384 poços | Perkin Elmer | 6008350 | Volume do ensaio 25 ml |
| Unidade de centrifugação Amicon 10.000 MWCO | Millipore | UFC901008 | Proteína concentrada |
| ampicilina | sigma | A0166 | Antibióticos |
| Agitador de bactérias Unimax 1010 | Heidolph | Bactérias de cultura | |
| clones de cDNA para FKBP51 humano | Fonte: BioScience | ID do clone: 5723416 | vetor pCMV-SPORT6 |
| clones de cDNA para FKBP52 humano | Fonte: BioScience | ID do clone: 7474554 | vetor pCMV-SPORT6 |
| E. coli quimicamente competente | Invitrogen | C602003 | Estrela BL21 de um tiro (DE3) |
| Dmso | Supelco | 1.02952.1000 | Compostos diluídos |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare a solução |
| Edta | Calbioquímica | 344504 | Prevenir a proteólise durante a sonicação |
| glutationa | sigma | G-4251 | Eluir proteínas marcadas com GST |
| Grânulos doadores de glutationa | Perkin Elmer | Nº 6765300 | Conta doadora |
| Coluna de armadilha GST | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purificar proteínas marcadas com GST |
| Isopropil-β-D-tiogalactosídeo | Thermo Fisher Científico | R0392 | Induza a expressão de proteínas |
| Caldo LB (Miller) | sigma | L3522 | Meio de crescimento microbiano |
| Instrumento de PCR | BIO-RAD | Termociclador S1000 | Amplificação/PCR |
| Coluna PD-10 | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Troca de soluções |
| vetor pGEX-6P-1 | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | plasmídeo |
| vetor pGEX-6P-2 | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | plasmídeo |
| Leitor de placas | Perkin Elmer | Leitor multietiquetas EnSpire 2300 | Leia a placa alfa |
| Software de leitura de chapas | Perkin Elmer | Gerente EnSpire | Software de leitura de chapas |
| Protocolo de software do leitor de placas | Perkin Elmer | Alfa 384 poços Baixo volume | Use este protocolo para ler a placa |
| PMSF | sigma | Pág. 7626 | Prevenir a proteólise durante a sonicação |
| coquetel de inibidores de protease | sigma | S8830 | Prevenir a proteólise durante a sonicação |
| Azida de sódio | sigma | S2002 | Como conservante |
| Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) | sigma | 156159 | Ativa a matriz para acoplamento |
| Dez peptídeos de aminoácidos NH2-EDASRMEEVD-COOH correspondentes aos aminoácidos 714-724 da isoforma Hsp90 beta humana | Peptídeo 2.0 inc | Sintetizar peptídeo C-terminal Hsp90 | |
| Rotador de tubo de ensaio | LABINCO | Faça agitação de ponta a ponta | |
| Tris-HCl | sigma | 10708976001 | Bloqueie locais não reagidos de contas aceitadoras |
| Interpolação-20 | sigma | Pág. 1379 | Evitar a agregação de grânulos |
| Ultra centrífuga Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrífuga para obter pellets de células bacterianas | |
| Disruptor de célula ultrassônico | Microssom | Sonicar células para liberar proteína | |
| Contas aceitadoras não conjugadas | Perkin Elmer | 6762003 | Grânulos do aceitador |
| Minicélula XCell SureLock e módulo de borrão XCell II | Invitrogen | EI0002 | PÁGINA SDS |
