Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificada: um ensaio de proximidade baseado em esferas para rastrear pequenas moléculas que inibem as interações proteína-proteína

Resumo

Fonte: Wang, L. et al., Estudos de interações chaperona-chaperona usando ensaio homogêneo baseado em contas. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado - um ensaio de proximidade baseado em esferas. Ele utiliza grânulos aceptores e doadores de tamanho homogêneo, imobilizados com duas proteínas que tendem a interagir para rastrear pequenas moléculas potenciais que inibem as interações proteicas.

Protocolo

NOTA: Uma visão geral deste protocolo é mostrada na Figura 1.

1. Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 1A)

1. Plasmídeos
   NOTA: Obtenha clones de cDNA para FKBP51 humano (id do clone: 5723416) e para FKBP52 humano (id do clone: 7474554) do consórcio IMAGE.
   1. Amplificar o DNA FKBP51 humano por PCR com primers (direto; 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contendo saliências de BamHI e XhoI e clonar no vetor pGEX6-1 em locais de restrição de BamHI / XhoI.
   2. Amplificar o DNA FKBP52 humano por PCR com primers (direto; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contendo saliências EcoRI e XhoI e clonar no vetor pGEX6-2 em locais de restrição EcoRI / XhoI.
      nota: A configuração e as condições da reação de PCR são mostradas na Tabela 1 e na Tabela 2.
   3. Verificar a sequência inserida e transformar os plasmídeos em E. coli quimicamente competente, de acordo com o protocolo de fabrico.
2. Expressão e purificação de proteínas
   1. Adicione 25 g de base de caldo Luria (LB) em 1 L de água destilada para fazer a solução LB. Autoclave-o a 121 °C por 15 min. Após o resfriamento, adicione 50 μg/mL de ampicilina.
   2. Pegue uma colônia de bactérias que expressam GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e misture com 500 μL de solução LB em um tubo de 1,5 mL. Vórtice.
   3. Adicionar a mistura de "1.2.2" a 1 l de solução LB no erlenmeyer coberto com uma folha de alumínio. Incubar o Erlenmeyer no agitador durante a noite a 37 °C.
   4. Induzir a expressão proteica adicionando 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) ao Erlenmeyer e continuar a incubação durante mais 2 h.
   5. Para obter pellets de células, centrifugue a 5.000 x g por 15 min. Remova o sobrenadante.
      nota: Os pellets celulares podem ser armazenados a -20 °C.
   6. Ressuspenda os grânulos celulares em 40 mL de PBS e sonice 3 x 20 s no gelo. Adicione 1 mM de PMSF, 1 mM de EDTA e coquetel de inibidores de protease (1 comprimido) para prevenir a proteólise.
   7. Centrifugue a suspensão por 30 min 50.000 x g para remover os detritos celulares e aplique o sobrenadante na coluna de armadilha GST de 5 mL.
   8. Após lavar a coluna com 30 mL de PBS, eluir GST-FKBP51 e GST-FKBP52 com 5 mL de glutationa 10 mM em PBS.
   9. Concentrar proteínas em 15 mL de unidade de centrifugação de 10.000 MWCO. Para remover a glutationa livre, passe os concentrados pela coluna PD-10 equilibrada com 0,5x PBS e concentre-se novamente no dispositivo de centrífuga do filtro.
   10. Colete frações contendo proteínas. Verifique as proteínas em SDS-PAGE e ajuste as concentrações de proteína para 1 mg/mL.
       nota: O rendimento típico de proteína é de 2-5 mg/L de cultura. A proteína pode ser armazenada a -20 °C.

2. Acoplamento do peptídeo C-terminal Hsp90 às esferas aceitadoras (Figura 1B)

1. Preparação do peptídeo Hsp90
   1. Sintetizar dez peptídeos de aminoácidos NH 2-EDASRMEEVD-COOH correspondentes aos aminoácidos 714-724 da isoforma beta Hsp90 humana (UniProt ID: P08238) por um serviço de síntese de peptídeos.
   2. Diluir o peptídeo Hsp90 em PBS até a concentração de 1 mg/mL.
2. Preparação de contas aceitadoras
   1. Diluir as esferas aceptorais não conjugadas em PBS até a concentração de 1 mg/ml e transferir para um tubo de 1,5 ml.
   2. Realize a lavagem por centrifugação a 16.000 x g por 15 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
3. conjugação
   1. Defina a proporção entre grânulos e peptídeos como 10:1. No tubo de 1,5 mL contendo 1 mg de grânulo aceptor (preparado conforme descrito acima), adicione 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de peptídeo diluído, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de uma solução 400 mM de cianoborohidreto de sódio (NaBH₃CN) em água.
      cuidado: NaBH₃CN é tóxico; Use um exaustor e luvas. A solução de NaBH₃CN deve ser preparada recentemente.
   2. Incubar durante 24 h a 37 °C com agitação de ponta a ponta (10-20 rpm) num agitador rotativo.
4. Têmpera de reação e lavagem de grânulos
   1. Adicione 20 μL de solução de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) à reação para bloquear locais não reagidos. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Centrifugue a 16.000 x g (ou velocidade máxima) por 15 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o grânulo em 1 mL de solução de Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Repita a etapa de lavagem três vezes.
   4. Após a última centrifugação, ressuspenda os grânulos a 1 mg / mL em tampão de armazenamento (1 mL de 0,5 × PBS com 0,01% de azida sódica como conservante). Armazene a solução de esferas aceptoras conjugadas a 4 °C protegidas contra luz.
      cuidado: A azida de sódio é tóxica; Use um exaustor e luvas.

3. O ensaio que investiga a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e o peptídeo C-terminal Hsp90 e a inibição com compostos de pequena massa molecular (Figura 1C)

1. Proteínas marcadas com GST interagindo com grânulos doadores de glutationa
   1. Configure as reações em placas de 384 poços.
   2. Preparar a solução contendo 10 μg/mL das esferas doadoras de glutationa em 0,5x PBS, pH 7,4.
      nota: Após armazenamento prolongado, as contas se acalmam e precisam ser reviradas.
   3. Adicione GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 a uma concentração final de 10 μg/mL.
   4. Incubar no escuro a 25 °C por 10 min.
      nota: Nesta etapa, as proteínas marcadas com GST irão interagir com a glutationa presa às contas. Para cada poço, serão utilizados 22,5 μL dessa mistura. A concentração dos parceiros vinculativos deve ser determinada empiricamente. Titule GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e escolha a concentração que dá o melhor sinal.
2. Adição de composto
   1. Faça diluições seriadas de compostos de teste em DMSO.
      nota: As concentrações usadas são tipicamente 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM.
   2. Adicione 0,25 μL de DMSO (controle negativo) ou peptídeo C-terminal Hsp90 (controle positivo, 30 μM) ou compostos em DMSO no canto de cada poço da placa. Use triplicados para cada concentração de composto.
   3. Adicione 22,5 μL da solução contendo grânulos doadores de glutationa com proteínas marcadas com GST em cada poço.
   4. Agite o prato suavemente com a mão, mas bem. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
      nota: Durante esse tempo, os compostos irão interagir com o domínio TPR no sítio de ligação do peptídeo C-terminal Hsp90.
3. Adição de contas aceitadoras
   1. Dilua as esferas aceitadoras com o peptídeo C-terminal Hsp90 anexado a 100 μg / mL em 0,5x PBS.
   2. Adicione 2,25 μL de grânulos aceptores diluídos a cada poço.
   3. Misture delicadamente, mas bem. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
      nota: Nesta etapa, os grânulos doadores e aceitadores são aproximados pelas interações proteína-peptídeo. O volume final da mistura de reação é de 25 μL. Portanto, as concentrações finais dos compostos variam de 0,1 a 30 μM.
4. Leitura da placa
   nota: Leia a placa usando um leitor de placas ajustado no modo relevante.
   1. Ligue o instrumento e abra o software
   2. Escolha o protocolo relevante.
   3. Clique em Editar mapa de placas e selecione o poço que está sendo usado na placa para medição.
   4. Clique em Avançar para continuar e Executar o protocolo selecionado.
   5. Após a medição, clique em Mostrar resultados para visualizar os resultados.
   6. Exporte os dados.

Tabela 1: Configuração da reação de PCR para amplificação do DNA humano FKBP51 e FKBP52.

Componente de reação	Volume (μL)
Tampão de PCR (5 x concentrado)	4
Primer direto	1
Primer reverso	1
plasmídeo	0,5
Mistura dNTP (10 mM cada)	0,5
Polimerase de DNA de fuso	0,5
Água (grau de DNA)	12.5
total	20

Tabela 2: Condições de termociclagem para amplificação de DNA FKBP51 e FKBP52 humano.

palco	Temperatura (°C)	Hora	Ciclos
Desnaturação inicial	94	3 minutos	1
desnaturação	94	30 segundos	35
recozimento	56	30 segundos
extensão	72	1 minuto
Extensão final	72	5 min	1
Nota: A temperatura da tampa é de 105 °C.

Resultados

Figura 1: Esquema deste protocolo. (A) Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Acoplamento do peptídeo C-terminal Hsp90 às esferas receptoras. (C) O ensaio que investiga a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e o peptídeo C-terminal Hsp90. Inibição com compostos de pequena massa molecular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 384 poços	Perkin Elmer	6008350	Volume do ensaio 25 ml
Unidade de centrifugação Amicon 10.000 MWCO	Millipore	UFC901008	Proteína concentrada
ampicilina	sigma	A0166	Antibióticos
Agitador de bactérias Unimax 1010	Heidolph		Bactérias de cultura
clones de cDNA para FKBP51 humano	Fonte: BioScience	ID do clone: 5723416	vetor pCMV-SPORT6
clones de cDNA para FKBP52 humano	Fonte: BioScience	ID do clone: 7474554	vetor pCMV-SPORT6
E. coli quimicamente competente	Invitrogen	C602003	Estrela BL21 de um tiro (DE3)
Dmso	Supelco	1.02952.1000	Compostos diluídos
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare a solução
Edta	Calbioquímica	344504	Prevenir a proteólise durante a sonicação
glutationa	sigma	G-4251	Eluir proteínas marcadas com GST
Grânulos doadores de glutationa	Perkin Elmer	Nº 6765300	Conta doadora
Coluna de armadilha GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purificar proteínas marcadas com GST
Isopropil-β-D-tiogalactosídeo	Thermo Fisher Científico	R0392	Induza a expressão de proteínas
Caldo LB (Miller)	sigma	L3522	Meio de crescimento microbiano
Instrumento de PCR	BIO-RAD	Termociclador S1000	Amplificação/PCR
Coluna PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Troca de soluções
vetor pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	plasmídeo
vetor pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	plasmídeo
Leitor de placas	Perkin Elmer	Leitor multietiquetas EnSpire 2300	Leia a placa alfa
Software de leitura de chapas	Perkin Elmer	Gerente EnSpire	Software de leitura de chapas
Protocolo de software do leitor de placas	Perkin Elmer	Alfa 384 poços Baixo volume	Use este protocolo para ler a placa
PMSF	sigma	Pág. 7626	Prevenir a proteólise durante a sonicação
coquetel de inibidores de protease	sigma	S8830	Prevenir a proteólise durante a sonicação
Azida de sódio	sigma	S2002	Como conservante
Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN)	sigma	156159	Ativa a matriz para acoplamento
Dez peptídeos de aminoácidos NH2-EDASRMEEVD-COOH correspondentes aos aminoácidos 714-724 da isoforma Hsp90 beta humana	Peptídeo 2.0 inc		Sintetizar peptídeo C-terminal Hsp90
Rotador de tubo de ensaio	LABINCO		Faça agitação de ponta a ponta
Tris-HCl	sigma	10708976001	Bloqueie locais não reagidos de contas aceitadoras
Interpolação-20	sigma	Pág. 1379	Evitar a agregação de grânulos
Ultra centrífuga Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrífuga para obter pellets de células bacterianas
Disruptor de célula ultrassônico	Microssom		Sonicar células para liberar proteína
Contas aceitadoras não conjugadas	Perkin Elmer	6762003	Grânulos do aceitador
Minicélula XCell SureLock e módulo de borrão XCell II	Invitrogen	EI0002	PÁGINA SDS