Ensaio de placa viral: uma técnica para medir o vírus herpes simplex infeccioso por meio da quantificação de placas formadas em monocamada de células infectadas por vírus

Resumo

Fonte: Sadowski, L. A. et al. Placa de vírus herpes simplex. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo descreve o ensaio de placa viral do vírus herpes simplex infeccioso ou HSV. As partículas virais diluídas são inoculadas na monocamada das células epiteliais. Após a incubação, o vírus forma placas e é contado visualmente para determinar o título do vírus infeccioso.

Protocolo

1. Semeadura das células Vero

1. Um dia antes de iniciar o ensaio de placa, tripsinizar as células Vero e ressuspendê-las no meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) regular e suplementar de acordo com a metodologia padrão de cultura de células. Ressuspenda as células tripsinizadas em 10 mL de DMEM por frasco T-75 das células Vero confluentes (~ 10⁷ células).
   NOTA: O DMEM é usado para ensaios de placa em vez de alfa-MEM porque diminui ligeiramente a taxa de crescimento celular e favorece melhores resultados de ensaio de placa.
2. Conte as células pelo método preferido (por exemplo, um hemocitômetro padrão com exclusão de azul de tripano).
3. Semeie as células em 4 x 10⁶ células/placa; para HSV-2, use placas de 6 poços com 2,5 mL de DMEM (com suplementos) por poço; e para HSV-1, use placas de 12 poços com 1,25 mL de DMEM (com suplementos) por poço.
   NOTA: O número de células deve ser constante, independentemente da placa usada, embora o tamanho dos poços seja importante no que diz respeito à precisão do ensaio de placa. É essencial distribuir as células uniformemente, o que pode ser realizado de forma mais eficaz movendo a placa para frente e para trás, não de forma circular.
4. Deixe as células crescerem durante a noite a 37 °C/5% de CO₂ em uma incubadora umidificada.
   NOTA: A umidade é mantida com uma panela de água destilada contendo um algicida no fundo da incubadora.

2. Diluição da amostra

1. Complete a diluição da amostra e a adição do vírus às células em uma sessão de laboratório.
   CUIDADO: HSV-1 e -2 são infecciosos para humanos e devem ser manuseados sob contenção de biossegurança adequada (BSL-2). Mantenha todos os materiais que entram em contato com o vírus separados e desinfete com um agente quaternário na diluição de 1/256 (consulte a Tabela de Materiais), iodóforo, alvejante ou detergente iônico forte (por exemplo, SDS) antes de removê-los do gabinete de biossegurança.
2. No dia seguinte à semeadura das células Vero, dilua em série cada amostra de vírus a ser plaqueada em 1x PBS; normalmente use diluições de 10 vezes para o rastreamento mais preciso.
3. Faça essas diluições até ^10-4 (para baixas concentrações de vírus) ou até ^10-9 (para expectativas de amostras de título mais alto) com pelo menos 1 mL de cada amostra restante para o próprio ensaio de placa.
4. Mantenha todas as diluições virais no gelo (não mais do que 1 h) até que esteja pronto para adicionar essas amostras de vírus diluídas às células.

3. Adição de vírus às células

1. Remover o meio de cultura celular de um ou dois alvéolos com uma pipeta.
   NOTA: Não use um aspirador porque ele remove muito líquido da monocamada celular e seca as células. Uma consideração crucial é garantir que a monocamada celular permaneça hidratada durante todo o curso do experimento. Se as células secarem, elas serão lavadas da placa na etapa final e gerarão dados inutilizáveis. Portanto, processe apenas um ou dois poços por vez para reduzir essa possibilidade.
2. Adicione cuidadosamente a amostra de vírus diluída (100-400 μL e 50-200 μL de amostra de vírus são usados para placas de 6 e 12 poços, respectivamente) gota a gota a cada monocamada, adicionando as gotas na lateral de cada poço. Repita o processo para cada um ou dois poços até que toda a placa esteja preenchida com as amostras de vírus que estão sendo plaqueadas.
   NOTA: Adicionar as gotas ao centro do poço pode inadvertidamente remover as células do substrato.
3. Balance suavemente toda a placa com a mão para garantir que o PBS que contém o vírus cubra toda a monocamada de células em cada poço e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C para permitir que o vírus seja adsorvido.
4. A cada 10 minutos em 1 h, remova a placa da incubadora, balance-a suavemente novamente para espalhar o vírus de maneira mais uniforme em cada poço e, em seguida, coloque-a de volta na incubadora.
   NOTA: Cada experimento ditará o número de réplicas e quais diluições são usadas; a preferência do leitor dita essa decisão.
5. Para diminuir a possibilidade de contagem inadvertida de inóculo não absorvido, remova a amostra de vírus dos poços com pontas de pipeta de 1000 μL e coloque-a em um copo de resíduos.
   NOTA: Novamente, este procedimento é realizado com apenas um ou dois poços por vez para manter a hidratação da monocamada celular.
6. Coloque 2,5 mL de uma camada de metilcelulose (dissolva 5% de metilcelulose p / p em 100 mL de PBS, autoclave por 15 min a 121 ° C e 15 psi em um ciclo líquido e, em seguida, adicione 375 mL de DMEM mais 25 mL de FBS).
7. Uma vez que uma placa inteira contenha revestimento, coloque a placa de volta na incubadora para permitir o crescimento por dois dias.
   NOTA: Se o vírus e as células crescerem por três dias, mesmo em DMEM mais suplementos, pode ocorrer uma perda substancial de células na monocamada, comprometendo assim os dados finais.
8. Desinfete o copo de resíduos, normalmente com a adição de alvejante, iodóforo ou virucida semelhante, antes de removê-lo do gabinete de biossegurança.

4. Coloração para placas

1. Após dois dias de incubação, remover a camada de metilcelulose com uma pipeta, novamente um ou dois alvéolos de cada vez, e colocá-la num copo de resíduos.
2. Adicione ~ 2 mL de violeta cristal a 1% (consulte a Tabela de Materiais) em etanol a 50% em cada poço para manchar as placas.
   NOTA: Não é essencial remover até a última gota da sobreposição.
3. Incubar a placa com todos os alvéolos preenchidos com a mancha durante 30 min a 37 °C. Neste ponto, desinfete o copo de resíduos como acima na etapa 3.8.
4. Lave as placas vigorosamente com água da torneira até que o escoamento esteja limpo.
   NOTA: Um fluxo suave de água não é vigoroso o suficiente; É necessária pressão total de um acessório de pia de laboratório.
5. Neste ponto, certifique-se de que haja aproximadamente 10 vezes
6. Deixe as placas secarem de cabeça para baixo durante a noite, após o que as placas individuais podem ser contadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 12 poços	Corning	3512
Placas de 6 poços	Corning	3516
Alfa-MEM	Lonza	12169F
Antibiótico/antimicótico	Gibco	15240096
Violeta de cristal	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
PBS de Dulbecco (sem Mg++ ou Ca++)	Gibco	14190144
Soro fetal de bezerro	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanil-L-glutamina (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacitômetro	Thermo Fisher	02-671-54
Metilcelulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Agente quaternário (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Azul Trypan	Corning	25900CI
tripsina	Cytiva	SH30042.01
Células Vero	ATCC	CCL-81