Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Ensaio TUNEL
- Eutanásia de animais que apresentem sinais clínicos de quitridiomicose e igual número de animais de controle Bd-negativos.
- Disseque amostras de pele (dorsal, ventral e coxa) de cada animal. Fixe as amostras de pele por 2 h em formaldeído tamponado com fosfato a 4% v / v. O tempo de fixação curto e consistente permite que os tecidos sejam totalmente fixados, mas também permite uma coloração imuno-histoquímica eficaz e precisa. Em seguida, transfira para etanol a 80% até a incorporação para seccionamento.
- Incorpore a pele em cera de parafina para preparação histológica seguindo métodos padrão. Resumidamente, o protocolo é o seguinte:
- Desidratar os tecidos em uma série graduada de etanol e limpar o etanol com xileno. Incorpore o tecido em cera de parafina e coloque todas as três amostras de pele de cada indivíduo em um bloco de parafina.
- Corte a pele usando um micrótomo seguindo a preparação histológica padrão. Corte o tecido em série a 5 μm e fixe-o em lâminas de vidro hidrofílico. Coloque quatro histossecções seriadas por tipo de pele por lâmina. Faça três lâminas por indivíduo com seções de pele em série, lembre-se de que cada lâmina tem quatro seções de cada tecido afixadas.
- Manchar as lâminas na seguinte ordem:
- Manchar a primeira lâmina com hematoxilina seguida de contracoloração de eosina (H&E). Este slide é para visualizar a localização dos esporângios Bd dentro da pele.
- Manchar a segunda lâmina após um ensaio TUNEL disponível comercialmente para preparação histológica e seguir as instruções do fabricante, descritas abaixo.
- Primeiro, desparafinize as seções de tecido em um frasco de coplin lavando as lâminas com três trocas de xileno por 5 min por lavagem e siga com duas trocas de etanol 100% por 5 min cada lavagem. Siga com uma lavagem de etanol a 95% por 3 min e depois etanol a 70% por 3 min. Finalize com uma lavagem de PBS por 5 min.
- Pré-trate o tecido com enzima de digestão de proteínas recém-diluída (proteinase K a uma concentração de 20 μg / mL diluída em PBS) e adicione diretamente na lâmina. Deixe incubar por 15 min. Lave com duas trocas de PBS em um frasco de coplin por 2 min cada.
- Retire o excesso de líquido e tempere em peróxido de hidrogênio a 3,0% em PBS em um frasco de coplin por 2 min em temperatura ambiente. Enxágue duas vezes com PBS, por cinco minutos a cada lavagem.
- Retire o excesso de líquido e aplique 75 μL / 5 cm2 do tampão de equilíbrio diretamente no tecido na lâmina. Incubar por 10 s. Retire o excesso de líquido ao redor da seção e aplique 55 μL / 5 cm2 da enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) em funcionamento. Incubar numa câmara humidificada durante 1 h a 37 °C.
- Após a incubação TdT, coloque a lâmina em um frasco de coplin de força de trabalho stop/wash buffer, agite por 15 s e incube por 10 min em temperatura ambiente. Lave a lâmina com três trocas de PBS por 1 min por lavagem. Retire o excesso de líquido.
- Aplique conjugado anti-digoxigenina (rodamina) que foi aquecido à temperatura ambiente no tecido, 65 μL / 5 cm2. Incubar em câmara umidificada por 30 min em temperatura ambiente e evitar a exposição à luz. Lave com quatro trocas de PBS por 2 min por lavagem. Retire o excesso de líquido.
- Termine adicionando 15 μL de DAPI de 0,5 - 1 μg/mL (4',6-diamidino-2-fenilindol) no meio de montagem da lâmina à lâmina, que atua como um contra-corante. Em seguida, cubra com uma lamínula e sele com esmalte ou cimento de borracha. Deixe as lâminas secarem no escuro, pois o ensaio é sensível à luz.
- Manchar a terceira lâmina usando o ensaio TUNEL e a contracoloração DAPI, mas usar como controle positivo e negativo para cada amostra.
NOTA: Das 4 histossecções nas lâminas de controle, as 2 primeiras são réplicas de controle positivo e as 2 últimas são réplicas de controle negativo.
- Para os controles positivos, em vez da etapa 1.5.2.2, pré-trate o tecido com tampão DN (30mM trizma base, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0,1mM DDT) e deixe incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, dissolva a Dnase I no tampão DN para uma concentração final de 0,1ug / mL e aplique-a diretamente na lâmina. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar a lâmina com 5 lavagens de dH2O durante 3 minutos de cada lavagem. Seque o excesso de líquido. Em seguida, retomar o ensaio TUNEL conforme indicado no ponto 1.5.2.3.
- Para os controlos negativos, não adicionar a enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) a essas amostras (conforme descrito no ponto 1.5.2.4).
2. Observe as lâminas TUNEL imediatamente após a conclusão do ensaio.
- Tire fotos em intervalos aleatórios ao longo de cada seção da pele a 200X usando um microscópio fluorescente, usando filtros para a coloração de rodamina, que revela as células apoptóticas e aparece em vermelho, e DAPI, que revela todos os núcleos e aparece em azul, para que uma sobreposição de células possa ser gerada. Certifique-se de que pelo menos 100 células sejam fotografadas por seção de pele por amostra. Armazene as lâminas em uma caixa de microscópio escura a -20 °C.
- Conte as células (coradas com DAPI azul) por imagem. Certifique-se de que pelo menos 100 células sejam contadas por seção de pele. Para chegar a 100 células, conte todas as células dentro da imagem. Se menos de 100 células estiverem presentes em uma imagem, conte outra imagem até que pelo menos 100 células sejam alcançadas por seção de pele por animal.
- Em seguida, conte o número de células positivas para TUNEL nas mesmas imagens (coradas com rodamina vermelha). As células positivas para TUNEL, que indicam apoptose e não necrose ou fundo, são células únicas com bordas celulares claras (as membranas estão intactas sem lise). Às vezes, as células encolhem para formar corpos apoptóticos.
- Localize as áreas contadas no ensaio TUNEL e analise as regiões correspondentes nas histosecções coradas com H&E. Confirme se as seções coradas com H&E correspondem a locais de infecção por Bd, o que garante que os locais infectados por Bd sejam usados na contagem de células apoptóticas no ensaio TUNEL.
