Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Criação e Monitoramento de Animais
- Abrigar os animais individualmente, em um ambiente apropriado para a espécie, com um cronograma adequado de água, alimentação e limpeza. Verifique os animais diariamente.
- Use indivíduos adultos da ameaçada Litoria verreauxii alpina (para o ensaio Caspase 3/7, Seção 4), doados de instalações de reprodução em cativeiro. Mantenha os animais a 15 - 18 ° C, em um substrato de musgo e cascalho, borrife-os diariamente com água de osmose reversa e alimente-os 3 vezes por semana com grilos carregados de tripa.
- Colete dados sobre cada indivíduo uma vez por semana. Esfregue os indivíduos para Bd conforme descrito na Etapa 2.1. Pesar cada animal com uma precisão aproximada de 0,1 g usando uma balança e medir o comprimento do focinho à ventilação (SVL) com precisão de 0,01 mm usando pinças de discagem.
- Após a inoculação (conforme descrito na secção 3), verificar diariamente os animais quanto a sinais clínicos de infeção (descamação irregular da pele, inapetência, vermelhidão das pernas, letargia ou reflexo de endireitamento retardado), em conformidade com as diretrizes de ética animal. Eutanásia dos animais se houver sinais clínicos e morbidade.
- Eutanasiar com uma overdose de metanossulfonato de tricaína (MS222) (0,1% p / v MS222 a pH 6 - 7 com bicarbonato de sódio em água da torneira envelhecida). Mantenha os animais no MS222 por 10 minutos depois que todo o movimento cessar e eles não apresentarem resposta aos estímulos.
2. Teste para infecção por Bd
- Esfregando para Bd
- Limpe cada animal com um novo cotonete de rayon estéril (um cotonete por animal). Use o seguinte método de swab: cinco vezes no ventre e cinco vezes em cada coxa, lado e membro. Este é um total de 45 tacadas.
- Gire suavemente o cotonete durante e entre os golpes para garantir a captura eficaz do DNA. Quebre a ponta do cotonete em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a -20 °C até a extração.
- Extração de DNA e ensaio de qPCR
- Extraia o DNA genômico dos swabs adicionando 50 μL de um reagente de extração de DNA disponível comercialmente com 30 a 40 mg de esferas de sílica de 0,5 mm. Bata as amostras em um disruptor de células batedor de esferas na velocidade máxima por 2 min. Seguindo a etapa do batedor de esferas, centrifugue as amostras a 2.000 x g por 1 min.
- Incubar as amostras a 100 °C durante 10 min e deixá-las arrefecer. Centrifugue as amostras a 5.000 x g por 3 min e, em seguida, transfira o sobrenadante para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mL e armazene a -20 ° C até qPCR.
- Use PCR quantitativo (qPCR) seguindo Boyle et al. 2004 para analisar a carga de infecção. Use as seguintes modificações:
- Diluir amostras de extração de DNA 6:100 com água duplamente deionizada. Adicione 0,7 μL de albumina de soro bovino (BSA) a cada poço para ajudar a prevenir a inibição da PCR. Execute cada amostra em singlicate. Em cada placa, utilizar um controlo negativo (sem molde) e um controlo positivo com uma série de padrões de diluição para estimar a carga de zoósporos (infecção).
3. Inoculação
- Cultura Bd
- Prepare o caldo de cultura adicionando 16 g de triptona, 2 g de hidrolisado de gelatina e 4 g de lactose (TGHL) a 1 L de água deionizada. Autoclave (121 °C durante 40 min) e deixe arrefecer o caldo.
- Inocular o isolado de Bd (neste caso, isolado do isolado de Nova Gales do Sul, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, passagem número 11) num caldo TGHL e crescer durante 7 dias a 23 °C, depois transferir a cultura do caldo para placas de ágar TGHL.
- Para fazer placas, adicione 16 g de triptona, 2 g de hidrolisado de gelatina, 4 g de lactose (TGHL) e 10 g de ágar bacteriológico a 1 L de água deionizada e autoclave (121 °C por 40 min). Quando a mistura estiver suficientemente fria para ser tocada, mas antes de solidificar, deite o ágar TGHL em placas de cultura de 92 mm de diâmetro, de modo a ficarem 1/4 a 1/3 cheias, numa cabina de segurança biológica de classe II.
- Quando o ágar-ágar estiver solidificado e resfriado completamente, inocule cada placa com 0,5 mL de Bd do caldo líquido e espalhe uniformemente. Deixe a mistura de caldo Bd secar em um prato por aproximadamente 1 h e, em seguida, sele as placas com filme plástico de parafina. Incubar as placas com o lado do ágar-ágar voltado para baixo a 23 °C durante 5 - 7 d.
- Placas de inundação para solução de inoculação de zoósporos
- Verifique a motilidade dos zoósporos sob um microscópio de luz invertida para garantir a viabilidade diariamente antes da inoculação. Quando a liberação de zoósporos é alta, com muitos zoósporos nadando fora dos esporângios, a cultura está pronta para a inoculação.
- Inunde cada placa com 3 mL de água da torneira envelhecida ou água artificial da lagoa, despejando a água na placa e incubando em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que os zoósporos sejam liberados na água. Após o período de incubação, decantar a suspensão de zoósporos para um novo recipiente estéril.
- Estime a concentração de zoósporos seguindo as instruções do fabricante usando um hemocitômetro. Uma vez conhecida a concentração da suspensão de zoósporos, diluir a suspensão para uma concentração de 1 x 106 zoósporos por 3 ml com água da torneira envelhecida.
- Inocular animais
- Inocular cada animal despejando 3 mL de mistura de inóculo sobre seu vértice em recipientes individuais de 50 mL. Permita que o excesso de inóculo se acumule na base do recipiente de inoculação. Deixe cada animal em um recipiente de inoculação individual por 24 h para garantir a infecção e, após a inoculação de 24 h, devolva cada indivíduo a um terrário desinfetado.
- Desinfete o terrário usando uma solução de alvejante comercial a 13% de volume / volume (v / v), enxágue pelo menos duas vezes com água e deixe secar por pelo menos 24 h.
- Para os controlos negativos para Bd, simular a inoculação dos animais utilizando os mesmos métodos que os descritos em 3.2 - 3.3, mas inundar placas de ágar-ágar isentas de Bd com 5 ml de água da torneira envelhecida em vez de placas de ágar-inoculadas com Bd.
4. Ensaio de caspase 3/7
- Colete as pontas dos dedos dos pés de cada animal (exposto a Bd e negativo a Bd) uma vez por semana até a semana 3 após a inoculação e quinzenalmente até o final do experimento, até 8 dedos por indivíduo.
- Corte a ponta do dedo do pé na segunda falange com uma tesoura esterilizada por chama, coloque em um microtubo de 1,5 mL e congele imediatamente a -80 ° C.
- Extraia proteínas da amostra congelada do dedo do pé.
- Coloque as amostras em 100 μL de tampão de amostra (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) com dois grânulos de aço inoxidável (3,2 mm) em um microtubo com tampa de rosca de 1,5 mL. Lise as amostras por 4 ciclos de 1 min batendo o cordão na velocidade máxima (no mesmo batedor de grânulos usado na etapa 1.2.1) seguido de 3 min no gelo. Após a lise, centrifugue as amostras a 12.000 x g e 4 °C por 5 min. Colete o sobrenadante para usar no ensaio.
- Quantifique a concentração de proteína por amostra usando o ensaio de Bradford.
- Em uma placa de 384 poços, misture 10 μL de extrato de proteína com 10 μL de reagente de Bradford e incube por 2 min em temperatura ambiente. Execute cada amostra em duplicata, juntamente com uma série de padrões de diluição BSA de 5 vezes. Ler a absorvância a 595 nm num leitor de placas de absorvância.
- Alternativamente, se as amostras da ponta do pé forem muito pequenas (a concentração de proteína estiver próxima do padrão mais baixo, conforme determinado pelo ensaio de Bradford, ou se as rãs amostradas tiverem menos de 3 g de peso total), padronize as amostras estimando a área da superfície da pele usando fotografias, em vez do ensaio de Bradford.
- Antes de extrair as proteínas da amostra para o ensaio de caspase, fotografe cada dedo do pé com ampliação de 40X usando um microscópio de luz invertida.
- Analise a amostra do dedo do pé usando um software de imagem de computador, estimando a área do dedo do pé. Faça isso desenhando uma linha ao redor da borda do clipe do dedo do pé e faça com que o software de imagem estime a área dentro da forma. Em seguida, multiplique essa área por pi (3.14), que se aproximará da área da superfície da amostra de pele tridimensional (como comprimento x área da seção transversal (pi x diâmetro) dá a área da superfície externa de um tubo).
- Realize o ensaio de caspase 3/7.
- Em uma placa de luminescência de 384 poços, adicione 10 μL de reagente de caspase 3/7 disponível comercialmente e 10 μL de extrato de proteína. Execute cada amostra em triplicado.
- Misture os reagentes agitando a placa lentamente por 15 s. Incube a placa longe da luz por 30 min em temperatura ambiente. Meça a luminescência usando um leitor de placas luminescentes.
