O ensaio de fagocitose: uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias de Drosophila melanogaster

Resumo

Fonte: Nonaka, S. et al. Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em embriões de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias homogeneizadas de Drosophila melanogaster. Este método fornece informações sobre a fisiologia celular, determinando a extensão do engolfamento celular apoptótico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Coloração de hemócitos

1. Imunocoloração com um anticorpo anti-Croquemort
   1. Mergulhe as lâminas de vidro em série em metanol por 10 min, em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 por 10 min e depois em PBS por 10 min.
   2. Monte 20 μL de soro suíno inteiro a 5% (v / v) em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 nas células para bloqueio. Incube as lâminas em temperatura ambiente por 20 min.
   3. Remova a solução das lâminas de vidro e monte 20 μL de anti-soro anti-Croquemort (0,1% (v / v)) em PBS contendo 0,2% (v / v) Triton X-100 nas células. Incubar as lâminas a 4 °C durante a noite.
   4. Mergulhe as lâminas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) Triton X-100 por 10 min 5 vezes.
   5. Mergulhe as lâminas de vidro em PBS por 10 min.
   6. Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo 0,2% (v / v) Triton X-100 e 5% (v / v) de soro suíno inteiro nas células em temperatura ambiente por 1 h.
   7. Mergulhe as lâminas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) Triton X-100 por 10 min 5 vezes.
   8. Mergulhe as lâminas de vidro em tampão contendo 100 mM de Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM de NaCl e 50 mM de MgCl2 por 10 min.
   9. Monte a solução de substrato de fosfatase contendo 0,23 mg / mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / mL de nitro azul de tetrazólio (NBT), 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl e 50 mM de MgCl₂ nas células.
   10. Observe as células ao microscópio para uma coloração adequada. Quando fortes sinais roxos aparecerem nos grânulos de hemócitos, remova a solução de substrato e mergulhe as lâminas de vidro em tampão consistindo de 10 mM de Tris-HCl, pH 8.5 e 1 mM de EDTA. Recomenda-se a coloração por aproximadamente 5 a 10 minutos.

2. Células apoptóticas de coloração por TUNEL

1. Mergulhe as lâminas de vidro em PBS por 5 min.
2. Repita com o novo PBS.
3. Monte o buffer de equilíbrio (consulte a tabela de materiais) nas células por 10 min.
4. Remova a solução das lâminas de vidro e monte 20 μL de solução TdT contendo 5 μL de desoxinucleotidil transferase terminal e 15 μL de tampão de reação nas células a 37 ° C por 1 h.
5. Remova a solução das lâminas de vidro e mergulhe as lâminas em um tampão composto por 0,5 mL de tampão STOP/Wash e 17 mL de água.
6. Mergulhe os slides em PBS por 5 min 3 vezes.
7. Monte 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidase nas células em temperatura ambiente por 30 min.
8. Mergulhe as lâminas de vidro em PBS por 5 min 4 vezes.
9. Mergulhe as lâminas de vidro em solução de substrato de peroxidase consistindo de 30 mL de Tris-HCl 50 mM, pH7.5 contendo uma microespátula completa de tetrahidrcloreto de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e 0.002% (v / v) H₂O₂ por 30 s.
10. Repita a etapa acima até que as células apoptóticas fiquem marrons. Mergulhe as lâminas de vidro em água para interromper a reação da peroxidase.
11. Envolva as células com água para observação.

3. Meça o nível de fagocitose de células apoptóticas

1. Observe as amostras ao microscópio óptico para avaliar o nível de fagocitose. Conte as células positivas para Croquemort ou GFP-positivas como hemócitos, as células positivas para TUNEL como células apoptóticas e as células duplamente positivas como hemócitos fagocitantes.
2. O índice fagocítico é definido como o número de células duplamente positivas em relação ao número total de células positivas para Croquemort ou células positivas para GFP. Recomenda-se que mais de 300 hemócitos sejam observados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
soro de suínos inteiros	MP Biomédicos	Rolamento 55993	Para bloqueio
Kpl Anti-Rato IgG (H + L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	anticorpo secundário para hemócitos corados com um anticorpo anti-Croquemort
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato	Roche	11383221001	BCIP, Para coloração de hemócitos
nitro azul tetrazólio	Roche	11383213001	NBT, para coloração de hemócitos
Anticorpo anti-Croquemort			descrito anteriormente em Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Kit de detecção de apoptose in situ Apop Tag Peroxidase	Millipore	S7100	Para coloração de células apoptóticas. Este kit inclui tampão de equilíbrio, tampão de reação, tampão STOP/Wash, enzima TdT e anti-digoxigenina-peroxidase.
3,3'-diaminobenzidina tetra-hidricloreto	nacalai tesque	11009-41	DAB, para coloração de células apoptóticas