Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Resumo

Fonte: Taruc, K., et al. Quantificação da Eferocitose por Microscopia de Fluorescência de Célula Única. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Cultura e Preparação da Linha Celular de Monócitos THP-1

1. Cultura de monócitos THP-1 em suspensão, cultura em frascos T25 a 37 °C + 5% de CO₂. As células devem ser cultivadas em 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% de soro fetal bovino (FBS).
2. Todos os dias, suspenda as células uniformemente em todo o meio de crescimento, agitando suavemente o frasco e, em seguida, conte imediatamente as células com um hemocitômetro. As células devem ser passadas quando a densidade celular atingir 1 x 10⁶ células/mL:
   1. RPMI 1640 + 10% FBS pré-aquecido em banho-maria a 37 °C.
   2. Transfira 2 x 10⁵ células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou um tubo cônico de 15 mL e células de pellets centrifugando a 500 x g em temperatura ambiente por 5 min.
   3. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e ressuspenda o pellet em 1 mL (tubo de microcentrífuga de 1,5 mL) ou 5 mL (tubo cônico de 15 mL) de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   4. Centrifugue o tubo a 500 x g à temperatura ambiente durante 5 min. Retire o PBS sem perturbar o grânulo da célula.
   5. Ressuspenda o pellet em 1 mL de RPMI 1640 novo + 10% FBS.
   6. Em um novo frasco T25, coloque 4 mL de meio aquecido e adicione as células ressuspensas de 1.2.5. Cultivar numa incubadora a 37 °C + 5% de CO₂ até que as células necessitem de ser passadas (normalmente 3 dias) ou até que as células sejam necessárias para uma experiência.
3. Para um experimento com macrófagos derivados de THP-1, remova o número necessário de células do frasco e da placa antes de passar:
   1. Coloque o número necessário de lamínulas de vidro circulares de 18 mm (espessura # 1,5) nos poços de uma placa de 12 poços - normalmente 1 lamínula por condição e / ou ponto de tempo. Em cada alíquota de poço 5 x 10⁴ monócitos THP-1. O número de células adicionadas a cada poço pode ser alterado, se necessário.
   2. Aumente o volume total de cada poço contendo células para 1 mL usando RPMI + 10% FBS aquecido a 37 ° C.
   3. Adicione 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a cada poço e cultive por 3 dias para induzir a diferenciação de monócitos THP-1 em células semelhantes a macrófagos.

2. Cultura e Preparação da Linha Celular de Macrófagos J774.2

1. Cultivar células J774.2 em frascos T25 a 37 °C + 5% de CO₂. As células devem ser cultivadas em 5 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de FBS e passadas assim que a cultura atingir 80-90% de confluência. Para células de passagem:
   1. Remova todos os meios do frasco e levante uma vez com 5 mL de PBS.
   2. Remova o PBS do frasco e substitua por 5 mL de DMEM fresco + 10% de FBS.
   3. Usando um raspador de células, raspe o fundo do frasco para suspender as células no meio. Pipete vigorosamente as células várias vezes para quebrar quaisquer agregados celulares.
   4. Dilua as células 1:5 removendo 4 mL da suspensão celular do frasco e substituindo-a por 4 mL de meio fresco. A suspensão celular restante pode ser descartada, usada para iniciar uma nova cultura celular em um novo frasco T25 ou usada para um experimento.
2. Para configurar um ensaio de eferocitose usando células J774.2:
   1. Um dia antes do início do experimento, suspenda as células J774.2 em 5 mL de meio fresco, conforme as etapas 1.1.1 a 1.1.3. Conte as células usando um hemocitômetro e prepare o volume necessário de células na concentração de 5 x 10⁴ células / mL.
   2. Coloque o número necessário de lamínulas de vidro circulares de 18 mm (espessura # 1,5) nos poços de uma placa de 12 poços. Em cada alíquota de poço 1 mL da suspensão de células 5 x 10⁴ células/mL.
   3. Cultura durante a noite para permitir que as células adiram à lamínula e se recuperem da passagem.

3. Cultura de macrófagos M2 humanos primários

1. Colete 10 mL de sangue humano heparinizado para cada placa de 12 poços de macrófagos M2 necessária.
2. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, coloque 5 mL de sangue humano em cima de 5 mL de meio de separação de células linfólito-poli pré-aquecido. Prepare vários tubos se estiver processando >5 mL de sangue em vez de usar tubos de maior volume.
3. Centrifugue a 300 x g por 35 min, usando aceleração média e sem interrupção.
4. Remova cuidadosamente a banda superior rica em células mononucleares usando um pipetador de plástico e transfira para um tubo de centrífuga de 50 mL. Se vários tubos foram preparados na etapa 3.2, as bandas podem ser agrupadas em um único tubo de 50 mL. Aumente o volume do tubo para 50 mL com PBS.
5. Centrifugue a 300 x g durante 8 min e retire o sobrenadante. Durante esta etapa, coloque lamínulas circulares autoclavadas de 18 mm de diâmetro (espessura # 1,5) em cada poço de uma placa de 12 poços.
6. Ressuspenda o pellet celular em 300 μL de RPMI 1640 sem soro por número desejado de poços; por exemplo, se 10 mL de sangue foram processados para preparar uma placa completa de 12 poços, suspenda o pellet celular em 3,6 mL de meio.
7. Adicione 300 μL da suspensão celular a cada poço contendo lamínula na placa de 12 poços. Incubar durante 1 h a 37 °C + 5% CO₂.
8. Lave suavemente a lamínula 3x com 1 mL de PBS aquecido para remover quaisquer células não aderentes.
9. Adicione 1 mL de RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL de M-CSF humano recombinante + antibiótico/antimicótico de cultura de células. Incubar a 37 °C + 5% CO₂ durante 5 dias.
10. Substitua o meio por RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL de M-CSF humano recombinante + 10 ng/mL de IL-4 humana recombinante + antibiótico/antimicótico de cultura de células. Incubar a 37 °C + 5% de CO₂ por 2 dias para completar a polarização M2.
11. Macrófagos polarizados devem ser usados nos próximos 3 dias.

4. Preparação de células jurkat apoptóticas

1. Cultura de células Jurkat em 5 mL de RPMI 1640 + 10% FBS a 37 °C + 5% CO₂. Jurkats são uma linha de células em suspensão e podem ser mantidos passando 1:5 em meio fresco e pré-aquecido a cada 3-5 dias.
2. Para preparar células apoptóticas, permita que a cultura de Jurkat cresça até alta densidade (4 a 5 dias após a passagem). Alíquota de 1,5 mL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e células de pellets por centrifugação a 500 x g por 5 min.
3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio RPMI 1640 sem soro contendo 1 μM de estaurosporina.
4. Incubar 16 h a 37 °C + 5% de CO₂ para tornar as células apoptóticas.
5. Se desejar, confirme a indução de apoptose colorando com Anexina V:
   1. Alíquota de 100 μL de cultura de células Jurkat tratadas com estaurosporina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Células de pellets por centrifugação a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 μL de meio RPMI 1640 sem soro.
   2. Adicione 1 μL de Anexina V conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e incube por 10 min em temperatura ambiente no escuro.
   3. Adicione 900 μL de PBS e transfira todo o volume para um único poço de uma placa de 12 poços contendo uma lamínula de vidro circular de 18 mm (espessura # 1,5). Gire para baixo em uma centrífuga equipada com um adaptador de placa a 200 x g por 1 min para forçar as células a aderirem à lamínula. Alternativamente, as células podem ser colocadas em uma lâmina com câmara para imagem.
   4. Imagem usando um microscópio de fluorescência.

5. Quantificando a captação e a dinâmica eferocítica usando um ensaio de eferocitose de células fixas e coloração de dentro para fora

1. Prepare macrófagos humanos THP-1, J774.2 ou M2 conforme descrito nas Seções 1-3, respectivamente.
2. Na noite anterior ao início do experimento, prepare células de Jurkat apoptóticas conforme descrito na Seção 4.
3. Imediatamente antes do experimento, conte as células apoptóticas usando um hemocitômetro. Transfira um número suficiente de células apoptóticas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL - geralmente adicionamos 5 x 10⁵ células / poço, fornecendo uma proporção alvo: eferócito de 10: 1.
4. Células Jurkat em pellets por centrifugação a 500 x g por 5 min e ressuspender em 500 μL de PBS.
5. Durante a centrifugação, alíquota de 10 μL de DMSO em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Dissolva no DMSO uma quantidade mínima de N-hidroxisuccinimidobiotina (NHS-Biotina). 5-10 cristais (~ 0,005 mg) são suficientes.
6. Transfira a suspensão de 500 μL de células apoptóticas/PBS para o tubo contendo DMSO/NHS-biotina. Em seguida, dilua um corante de rastreamento celular até a concentração recomendada pelo fabricante na suspensão de células apoptóticas. Certifique-se de selecionar um corante de rastreamento celular que não se sobreponha espectralmente ao FITC-Streptavidin (por exemplo, corante de rastreamento de células vermelho ou vermelho distante).
7. Incubar a suspensão por 20 min em temperatura ambiente no escuro. Adicione um volume igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incube por 5 min em temperatura ambiente no escuro para extinguir qualquer corante que não tenha reagido.
8. Células pellets por centrifugação a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células apoptóticas coradas em 100 μL de RPMI 1640 + 10% FBS por poço de macrófagos.
9. Adicione 100 μL de suspensão de células apoptóticas coradas gota a gota a cada poço de macrófagos. Centrifugue 200 x g por 1 min em uma centrífuga equipada com um adaptador de placa para forçar o contato entre macrófagos e células apoptóticas.
10. Incubar a placa pelo período de tempo desejado a 37 °C + 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura de tecidos. Para macrófagos, o material eferocitado geralmente é detectável pela primeira vez após 20 a 30 minutos e é concluído após 120 a 180 minutos.
11. No(s) ponto(s) de tempo desejado(s), remova as células da incubadora. Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS em temperatura ambiente para interromper a eferocitose e remover as células apoptóticas não eferocitadas.
12. Adicione estreptavidina conjugada com FITC em uma diluição de 1:1.000 a cada poço e incube por 20 min no escuro. Isso rotulará a biotina exposta em qualquer material de célula apoptótica não eferocitada.
    nota: Se desejado, os núcleos celulares podem ser corados durante esta etapa pela adição de diluição de 1:20.000 de Hoechst 33342 ou 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato (DAPI).
13. Lave as células 3 vezes com 1 mL de PBS, agitando suavemente ou balançando as amostras por 5 min por enxágue. Fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS por 20 min em temperatura ambiente. Enxágue as células uma vez com PBS para remover o excesso de PFA.
14. Monte lamínulas em uma lâmina para obter imagens e transfira para um microscópio de fluorescência. Capture pilhas z de um número suficiente de células para uma quantificação precisa - normalmente de 10 a 30 células por condição. O material celular apoptótico não internalizado será aparente na imagem resultante como material marcado com corante de rastreamento celular envolto pela coloração de estreptavidina FITC, enquanto o material eferocitado forma pontos discretos de corante de rastreamento celular livre de qualquer coloração de estreptavidina.
15. Quantifique a eferocitose nas imagens resultantes por meio de uma variedade de medidas:
    1. Calcule o índice eferocítico determinando o número médio de eferrossomos discretos (corante de rastreamento celular + / estreptavidina-puncta) por macrófago. Quantifique apenas macrófagos ligados a uma célula apoptótica ou contendo ≥1 eferrossomos visíveis. Registre macrófagos ligados a uma célula apoptótica, mas sem eferrossomos discretos, como tendo um índice eferocítico de 0.
    2. Calcule a eficiência eferocítica medindo a fração de macrófagos que contêm ≥1 eferrossomo.
    3. Calcule a taxa de eferocitose por meio de imagens de células fixadas e coradas em vários pontos de tempo. Apenas macrofagos de imagem ligados a células apoptóticas, ou contendo eferossomos visíveis, com z-stacks capturados de cada célula. Uma vez fotografado, determine a taxa de eferocitose:
       1. Usando a coloração de estreptavidina como guia e a ferramenta de seleção à mão livre ou polígono em FIJI / ImageJ (ou outro pacote de software de análise de imagem), circule todo o corante de rastreamento celular + / estreptavidina- (por exemplo, internalizado) material em um único plano da pilha z. Meça a intensidade integrada do corante de rastreamento celular nesta região. Medidas individuais para cada efernossomo (por exemplo, diâmetro, posicionamento em relação à borda ou núcleo da célula, etc.) podem ser facilmente adquiridas simultaneamente com essas medições, aumentando muito os dados coletados durante a análise.
       2. Na mesma seção z, usando a coloração de estreptavidina como guia e a ferramenta de seleção à mão livre ou polígono, circule todo o material de rastreamento celular + / estreptavidina + (por exemplo, não internalizado) em um único plano da pilha z. Inclua apenas a coloração de células apoptóticas em contato com o fagócito. Meça a intensidade integrada desta região.
       3. Repita as etapas 4.2.3.1 a 4.2.3.2 para as seções z restantes da imagem. Somar a intensidade integrada dos materiais eferocitados (Σ_eff) e não eferocitados (Σ_ne). A fração da célula apoptótica que foi eferocitada pode ser calculada para a célula como:
          
       4. Quantificar a fração eferocitada para todas as células em todos os momentos. Observe que a intensidade fluorescente das células/eferrossomos apoptóticos pode variar entre as imagens devido a variações na absorção de corantes de rastreamento celular por células apoptóticas individuais e devido a mudanças nos parâmetros de aquisição de imagem, como tempo de exposição. Como tal, compare apenas valores normalizados, como Fração Eferocitada, ou valores independentes de intensidade, como índice eferocítico e eficiência eferocítica, entre imagens, entre condições experimentais e entre experimentos repetidos.
    4. Para garantir que o conjunto de dados resultante reflita com precisão a variação na eferocitose entre as células, realize essas análises no número máximo de células possíveis em cada experimento.
       nota: A eficiência eferocítica e o índice eferocítico podem ser calculados rapidamente (alguns segundos/célula), e normalmente pretendemos analisar pelo menos 100 células por experimento, repetindo cada experimento pelo menos 3 vezes. O cálculo da fração de material eferocitado e as medidas específicas do efernossomo são mais trabalhosos, normalmente levando de 2 a 3 min/célula para um analista experiente. Para esses cálculos, quantificamos um mínimo de 15 células por condição, por experimento.
    5. Registre o índice eferocítico, a fração eferocitada e os dados individuais do eferossomo por célula.
       nota: Isso permite a análise de dados usando abordagens de célula única, permitindo assim que as variações entre células sejam quantificadas. Análises em nível populacional ainda podem ser conduzidas nesses conjuntos de dados, calculando a média de dados de uma única célula adquiridos em experimentos individuais. As medições específicas do efernossomo podem ser analisadas no nível da população, no nível de uma única célula e como conjuntos (por exemplo, como populações de eferrossomos independentes das células que os contêm).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640 Mídia	bisonte europeu	3500-000-EL
Mídia DMEM	bisonte europeu	319-005-CL
Soro fetal bovino (FBS)	bisonte europeu	Nº 080-150
Pbs	bisonte europeu	311-010-CL
Lamínulas de vidro circulares de 18 mm com espessura #1,5	Ciências da Microscopia Eletrônica	72290-08	O tamanho e a forma da lamínula não são críticos, mas 18 mm se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços, o que simplifica a cultura de células
Estaurosporina	Cayman Chemical	Rolamento 81590	Dissolva em DMSO a 1 mM (solução estoque 1.000x)
Anexina V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotina	ThermoFisher	20217	Conservar num exsicador. Não prepare uma solução padrão.
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Laranja	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	Nº 62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Meio de separação de células linfólito-poli	Laboratórios Cedarlane	CL5071
M-CSF humano recombinante	Peprotech	200-04
IL-4 humana recombinante	Peprotech	300-25
Linha celular de macrófagos J774.2	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
Linha celular de monócitos humanos THP-1	ATCC	TIB-202
Linha celular Jurkat T	ATCC	TIB-152