Ensaio de Monitoramento da Acidificação Intestinal: Uma Técnica para Estudar a Acidificação do Lúmen Intestinal em Drosophila usando Corante Azul de Bromofenol

Neste artigo

Resumo

Fonte: Abu, F., et al. Monitorando a acidificação intestinal no intestino adulto de Drosophila. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar a acidificação intestinal em moscas Drosophila. Após a ingestão de alimentos suplementados com um corante indicador de pH, a acidificação do lúmen intestinal resulta em uma mudança na cor do corante. A inspeção visual do trato digestivo das moscas para examinar a mudança de cor fornece evidências de acidificação.

Protocolo

NOTA: A linha de laboratório padrão Oregon R foi usada como controle WT. Todas as moscas foram criadas em meio padrão de fubá-melaço (contendo melaço, ágar, levedura, fubá, tegosept, ácido propiônico e água) à temperatura ambiente com ritmo circadiano claro/escuro de 12/12 h.

1. Preparação para o ensaio

Colete moscas fêmeas (0-2 dias de idade, não virgens) sob anestesia com CO₂ e permita que elas se recuperem com alimentos padrão de fubá por pelo menos 3 dias antes dos experimentos.
Deixe as moscas morrerem de fome por ~ 24 h em temperatura ambiente (~ 23 ° C) em frascos contendo um lenço de limpeza de laboratório embebido em ~ 2 mL de água deionizada.
Prepare o alimento para moscas com azul de bromofenol (BPB) da seguinte forma:
1. Derreta a comida de mosca no micro-ondas e deixe esfriar até ficar morna.
2. Adicione 1 mL de BPB a 4% a 1 mL de alimentos mornos e misture bem.
3. Usando uma pipeta, adicione o alimento para moscas contendo BPB em um único ponto (~ 200 μL) no centro de uma placa de Petri.

2. Ensaio de monitorização da acidificação intestinal

Transfira moscas famintas para uma placa de Petri contendo pontos únicos (200 μL) de alimento para moscas suplementado com 2% de azul de bromofenol (BPB). Deixe as moscas forragear por 4 h em temperatura ambiente enquanto expostas à luz.
Após 4 h, colete as moscas e anestesiá-las no gelo; isole cirurgicamente suas entranhas.
1. Realize a cirurgia em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) com fórceps sob estereomicroscópio (consulte a Tabela de Materiais). Isole o intestino segurando o tórax com um par de pinças e puxando o abdômen para baixo com um segundo par até que o CCR do intestino seja visível, tomando cuidado para garantir que o intestino permaneça preso em ambas as extremidades.
Determine a acidificação do intestino examinando a cor do CCR do intestino (Figura 1C; amarelo indica acidificado e azul indica não acidificado).
Conte apenas as moscas que apresentam coloração robusta de BPB em suas entranhas.
Calcule a porcentagem usando a seguinte equação:
Porcentagem de moscas com tripas acidificadas = número de moscas acidificadas × 100 / (número de moscas acidificadas + número de moscas não acidificadas)
nota: Uma porcentagem de 0 indica que nenhuma mosca acidificou seu intestino, enquanto uma porcentagem de 100 indica que todas as moscas acidificaram seu intestino.

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Resultados

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Figura 1: Monitoramento da acidificação intestinal.(A) Desenho esquemático da arena de alimentação. O ponto azul representa o alimento para moscas com azul de bromofenol (um corante indicador de pH). Outras manchas representam moscas-das-frutas. (B) Representação gráfica da porcentagem de moscas mostrando acidificação intestinal alimentada por diferentes durações ao ...