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1. Reagentes e soluções
- Produzir 500 mL de tampão MS-EGTA para isolamento mitocondrial: 225 mM de manitol, 75 mM de sacarose, 5 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 1 mM de etilenoglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N',N'-tetracético (EGTA), pH ajustado para 7,4 com KOH. Esterilize-o através de um filtro de 0,22 μm e armazene-o a 4 °C. Certifique-se de que o tampão MS-EGTA seja pré-resfriado a 4 °C antes de usar.
- Prepare 100 mL de tampão KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA e pH ajustado para 7,2 com KOH. Armazene-o em temperatura ambiente.
- Preparar 1 mM de caldo verde de cálcio-5N em dimetilsulfóxido (DMSO). O estoque de cálcio verde-5N pode ser alíquotado e armazenado a -20 °C.
- Preparar substratos para absorção de Ca2+.
- Prepare 1 M de piruvato de sódio, pH 7,4. Armazená-lo em alíquotas a -20 °C.
- Prepare malato 500 mM, pH 7,4. Armazená-lo em alíquotas a -20 °C.
2. Isolamento de mitocôndrias cardíacas
- Eutanásia do camundongo de acordo com os padrões institucionais.
nota: Para nosso método de eutanásia aprovado institucionalmente, os camundongos foram anestesiados por inalação de isofluorano e sacrificados por luxação cervical.
- Colete o coração abrindo a cavidade torácica, cortando ao longo de ambos os lados das costelas, flanqueando o coração, cortando o diafragma e excisando o tecido cardíaco.
nota: Neste protocolo, o isolamento mitocondrial é realizado a partir de um coração inteiro coletado de um camundongo adulto (aproximadamente 120 mg), o que deve ser suficiente para 3-4 experimentos. Para o isolamento mitocondrial de outros tecidos ricos em mitocôndrias, como o fígado, até 200 mg de tecido podem ser usados seguindo o protocolo descrito.
- Enxágue bem o tecido em 25 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada, garantindo que todo o sangue seja espremido para fora dos ventrículos.
nota: O coração será suficientemente enxaguado quando o líquido espremido para fora do coração sair claro.
- Pique o coração em pedaços pequenos em 5 mL de 1x PBS gelado usando uma tesoura afiada.
- Descarte o PBS e transfira o tecido cardíaco picado para um homogeneizador Dounce de vidro-Teflon pré-resfriado de 7 mL com uma folga de 0,10 a 0,15 mm.
- Adicione 5 mL de tampão MS-EGTA gelado e homogeneize a amostra até que os pedaços de tecido não sejam mais visíveis (aproximadamente 11 golpes).
nota: Não homogeneizar demais o tecido, pois o objetivo é obter mitocôndrias intactas e funcionais.
- Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 ml.
- Centrifugar o homogenato a 600 x g a 4 °C durante 5 minutos para granular núcleos e células intactas.
- Transfira o sobrenadante para um tubo novo de 15 ml e centrifugue-o a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min para sedimentar as mitocôndrias.
- Descarte o sobrenadante e mantenha o pellet mitocondrial no gelo.
- Lave o pellet mitocondrial duas vezes usando tampão MS-EGTA gelado. Para cada lavagem, ressuspenda o pellet mitocondrial em 5 mL de tampão MS-EGTA, centrifugue-o a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min e descarte o sobrenadante.
- Após a lavagem final, descarte o sobrenadante e ressuspenda as mitocôndrias em 100 μL de tampão MS-EGTA gelado. Mantenha as mitocôndrias no gelo.
nota: As mitocôndrias devem ser usadas para experimentação dentro de 1 h.
- Meça a concentração de proteína mitocondrial usando um ensaio de proteína de Bradford.
3. Medição baseada em leitor de placas da captação de cálcio mitocondrial
NOTA: Aqui é descrito o protocolo de análise da captação mitocondrial de Ca2+ utilizando um leitor de placas multimodo equipado com injetores. Qualquer leitor de placas com capacidade de leitura de fluorescência de cálcio verde-5N (excitação/emissão de 506/532 nm) em modo cinético com injetores de reagentes automatizados para manter a reação protegida da luz pode ser usado.
- Programe o leitor de placas para realizar uma leitura cinética da fluorescência verde de cálcio-5N com medições feitas a cada segundo para um tempo total de ensaio de 1.000 s. Além disso, programe os injetores de reagentes para dispensar 5 μL de solução de CaCl2 nos pontos de tempo de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s e 690 s.
nota: O tempo das injeções de CaCl2 é definido pelo usuário e pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais.
- Prepare os injetores de reagente com a solução de CaCl2 a ser usada.
nota: A concentração da solução de CaCl2 é definida pelo usuário e pode ser ajustada em execuções subsequentes para titular a quantidade de Ca2+ necessária para acionar a abertura do MPTP.
- Adicione 200 μg de mitocôndrias a um poço individual de uma placa de 96 poços.
- Adicione o volume apropriado de tampão KCl ao poço, de modo que o volume total de mitocôndrias e tampão KCl chegue a 197 μL.
- Adicionar 1 μL de piruvato 1 M e 1 μL de malato 500 mM à mistura mitocondrial. Pipete suavemente para misturar e incubar as mitocôndrias com os substratos por 2 min em temperatura ambiente para permitir que as mitocôndrias fiquem energizadas.
- Adicione 1 μL de estoque de cálcio verde-5N 1 mM. Misture delicadamente pipetando.
nota: Proteger a reação da luz após a adição do corante verde de cálcio-5N.
- Inicie o protocolo cinético pré-programado e monitore a fluorescência verde de cálcio-5N.