1. Preparação de Vesículas Unilamelares Grandes (LUVs)
- Prepare LUVs para seu uso como imitadores de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.
- Misture com uma seringa de vidro Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g/mol), esfingomielina (SM, 760,22 g/mol) e colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na proporção molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução-mãe de cada lípido solubilizado num solvente metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/ml num balão de vidro de fundo redondo de 25 ml. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução estoque misturando 126 μL, 117 μL e 31 μL, respectivamente.
cuidado: O metanol é um solvente tóxico e inflamável e o clorofórmio é tóxico e cancerígeno. Ambos devem ser manuseados com a proteção adequada sob um capô.
- Evaporar metanol/clorofórmio usando um evaporador rotativo sob vácuo durante 45-60 min a 60 °C até a formação de um filme lipídico seco.
- Prepare duas soluções tampão HEPES estoque. Prepare o tampão HEPES 1 misturando HEPES 20 mM (238.3 g/mol) e NaCl 75 mM (58.44 g/mol) e ajuste o pH para 7.4. Prepare o tampão HEPES 2 misturando 20 mM de HEPES e 145 mM de NaCl e ajuste o pH para 7,4. Os tampões HEPES podem ser armazenados a 4 °C por 1 mês.
nota: Recomenda-se verificar a osmolaridade dos tampões usando um osmômetro.
- Prepare a solução de hidratação lipídica dissolvendo o par de têmpera de corante fluorescente impermeável à membrana, ácido 8-aminonaftaleno-1, 3, 6-trissulfônico, sal dissódico a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g / mol) e brometo de p-xileno-bispiridínio a 45 mM (DPX, 422,16 g / mol) em solução tampão HEPES. A mistura de ANTS com DPX leva a uma solução de cor amarela. Para atingir as concentrações de 12,5 mM de ANTS e 45 mM de DPX, dissolver 21,4 mg e 76 mg, respectivamente, em 4 mL de tampão HEPES 1,
nota: A solução de hidratação lipídica pode ser armazenada por 2 semanas a 4 ° C, envolvendo o tubo com papel alumínio.
- Reconstituir vesículas multilamelares (MLV) ressuspendendo o filme lipídico seco com 1 mL da solução lipídica de hidratação e por vórtice até a dissolução do filme lipídico seco. Certifique-se de que a solução esteja completamente solubilizada, pois pequenos agregados lipídicos afetarão negativamente as etapas anteriores. Além disso, verifique a parede do frasco de vidro de fundo redondo para garantir que não haja nenhum filme lipídico remanescente.
nota: A solução ficará opalescente e amarela clara após a solubilização.
- Sujeite as vesículas a cinco ciclos de congelamento/descongelamento para obter vesículas unilamelares. Execute cada ciclo colocando o frasco de vidro de fundo redondo por 30 s em nitrogênio líquido para a etapa de congelamento e, em seguida, deixando-o em banho-maria por 2 min para a etapa de descongelamento.
nota: A temperatura da água do banho deve ser 5-10°C mais alta que a temperatura de fusão dos lipídios.
- Prepare a extrusora de lipídios inserindo dois suportes de filtro umedecidos preliminarmente com tampão HEPES em cada peça extrusora de politetrafluoretileno (PTFE) colocada no recipiente da extrusora de metal.
- Coloque uma membrana de policarbonato umidificado HEPES (tamanho de poro de 0.1 μm, 25 mm de diâmetro) na parte superior de um suporte de filtro.
- Monte as duas caixas da extrusora de metal e aparafuse-as.
- Coloque a extrusora montada no suporte e introduza uma seringa de 1 mL no orifício apropriado na extremidade de cada peça extrusora de politetrafluoretileno. A extrusão corresponde à passagem do líquido testado de uma seringa para a outra através da membrana de policarbonato.
- Teste a extrusora com 1 mL de tampão HEPES carregado em uma das seringas de 1 mL para garantir que não haja vazamentos ou problemas.
- Substitua o tampão HEPES de 1 mL pela amostra MLV.
- Realize a extrusão passando a amostra de MLV de uma seringa para a outra através da membrana de policarbonato pelo menos 21 vezes para obter LUVs uniformes do mesmo tamanho.
nota: A extrusão deve ser realizada a uma temperatura superior à temperatura de fusão da mistura lipídica.
2. Purificação de LUVs
- Prepare uma purificação de coluna para remover o excesso de ANTS e DPX não encapsulado.
- Introduzir gel de dextrano reticulado (G-50) ressuspenso em meio aquoso com 0,01% de NaN3 (65 g/mol) em uma coluna de cromatografia líquida (Luer Lock, não revestido, 1,0 cm x 20 cm, volume do leito 16 mL) até 1 cm abaixo do topo da parte incolor da coluna.
- Abra a torneira e deixe o líquido fluir para assentar o gel de dextrano reticulado.
- Lave a coluna eluindo com 20 mL de tampão HEPES 2 e descarte o fluxo de saída da coluna.
- Feche a torneira assim que o volume morto de solvente acima da coluna estiver minimizado (<100 μL), mas suficiente para evitar qualquer secagem do gel de dextrano reticulado.
- Coloque os LUVs recém-extrudados (amarelos) na coluna e deixe-os entrar no gel de dextrano reticulado.
- Adicione continuamente o buffer HEPES 2 à coluna para realizar a purificação do LUV.
- Eluir aproximadamente 2 mL de tampão HEPES 2 (não se esqueça de encher regularmente o topo da coluna para evitar a secagem do gel de dextrano reticulado): a solução amarela livre de ANTS e DPX migra mais lentamente do que os lipossomas.
- Comece a coletar LUVs purificados em tubos (1,5 mL).
- Observe as gotas de eluente da coluna e, quando se tornam opalescentes, contêm lipossomas. Troque o tubo para recuperar a fração contendo LUV.
- Eluir até que as gotas deixem de ser opalescentes (~1 ml). Em seguida, eluir mais 0,5 mL em uma fração separada e interromper a eluição.
NOTA: Os padrões agora estão disponíveis em uma ampla gama de pesos moleculares, como kits ou pesos moleculares individuais para calibrar o volume de eluição dos LUVs.
- Enrole os tubos com os LUVs em papel alumínio para evitar o branqueamento do corante de fluorescência.
- Lave a coluna com 20 mL de tampão HEPES 2.
- Os LUVs podem então ser armazenados por uma semana a 4 °C.
NOTA: Como a estabilidade do LUV pode depender da concentração e composição do LUV, bem como da força iônica, o tamanho dos LUVs deve ser controlado usando um instrumento de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (consulte a seção 4. Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV) antes de cada teste.
3. Quantificar a concentração de LUVs
- Estimar a concentração de LUV por um kit de quantificação de fosfolipídios, que permite a avaliação da concentração de colina. Este ensaio pode ser aplicado quando os fosfolipídios com colina contendo cabeça polar são substanciais (>50% dos LUVs).
- Prepare o reagente de cor dissolvendo 18 mg de substrato cromógeno em 3 mL de tampão fornecido.
- Carregue uma cubeta de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, com 3 mL de reagente de cor.
- Use o reagente de cor pura como condição em branco (em branco). Adicione 20 μL de amostra LUV (Teste) ou 20 μL de solução padrão de concentração de colina conhecida (Padrão).
- Misture bem e incube por 5 min a 37 ° C em todas as condições (em branco, teste e padrão).
- Medir a absorvância (densidade óptica, DO) da amostra para ensaio e da solução-padrão com a solução em branco como controlo a 600 nm com um espectrofotómetro.
- Verificar os valores de DO que permitem estimar a concentração lipídica dos LUVs, C[LUV], em colina equivalente em comparação com o padrão de concentração conhecido.
- Execute o cálculo usando a seguinte equação:
C[LUV] (mol/l) = (Amostra OD/Padrão OD) x C[Padrão] (mol/l)
NOTA: O kit de quantificação de fosfolipídios forneceu uma solução padrão de cloreto de colina (139,6 mg / l) a 54 mg / dL correspondente à concentração molar de C [Padrão] = 3,87 mmol / L. OD Sample e OD Standard são as absorbâncias medidas a 600 nm para as soluções LUV e Colina, respectivamente.
4. Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV
- Realize uma medição usando um instrumento DLS para determinar o tamanho do LUV (em nm) e o índice de polidispersidade (PdI).
- Programe o "procedimento de operação padrão" (SOP) apropriado indicando a viscosidade do solvente/tampão e da cubeta usada.
- Colocar 500 μL da solução LUV numa cubeta semimicromicro de poliestireno.
- Insira a cubeta semimicro de poliestireno em um instrumento DLS.
- À temperatura ambiente, medir a distribuição de tamanho em termos de tamanho médio (média Z) da distribuição de partículas e de homogeneidade (índice de polidispersão, PdI).
- Todos os resultados são obtidos a partir de duas medições independentes realizadas cada uma em três ciclos repetitivos.
NOTA: Os valores padrão para LUVs serão um tamanho médio de 137 ± 7 nm com um PdI de 0.149 ± 0.041.
5. Preparando soluções peptídicas
- Prepare uma solução de estoque do peptídeo, que deve ser analisada para o ensaio de vazamento.
- Dissolva o pó de peptídeo (>95% de pureza) em água pura (por exemplo, 1 mg de peptídeo em 500 μL de água pura).
nota: Recomenda-se diluir peptídeos em água pura e evitar a solubilização de dimetilsulfóxido (DMSO), que pode induzir artefatos (por exemplo, permeabilização da membrana).
- Vortex a solução peptídica por 5 s.
- Sonicar a solução peptídica em um banho de sonicação de água por 5 min e depois centrifugar por 5 min a 12,225 x g. Recolha o sobrenadante para determinação da concentração.
- Meça a absorbância a 280 nm de três diluições peptídicas independentes e, em seguida, calcule a concentração de peptídeos usando seu coeficiente de extinção molar ε (dependendo do teor de triptofano e tirosina na sequência peptídica) e regra de Beer-Lambert.
nota: Se o peptídeo contiver triptofano e tirosina, o coeficiente de extinção molar ε é calculado com base no triptofano ε = 5.690 M-1 cm-1 e tirosina ε = 1.280 M-1 cm-1. Se a sequência peptídica não contiver triptofano ou tirosina, outro ensaio colorimétrico pode ser realizado para medir a concentração (por exemplo, BCA ou Bradford).
- Diluir a solução peptídica em água pura até obter uma solução final de 100 μM e conservar a 4 °C.
nota: Em água pura, não ocorre degradação de peptídeos durante o armazenamento a 4 °C. No entanto, a concentração de peptídeos deve ser medida a cada 2 semanas para garantir que não ocorra evaporação da água.
6. Ensaio de fuga de fluorescência
- O ensaio de vazamento de fluorescência é medido em um espectrofluorômetro à temperatura ambiente. O comprimento de onda de excitação e emissão é fixado em Ex = 360 nm ± 3 nm e Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.
- Diluir LUVs em 1 mL de tampão HEPES 2 até uma concentração final de 100 μM em uma cubeta de fluorescência de quartzo. Adicione um agitador magnético para homogeneizar a solução durante o experimento.
- Meça as LUVs sozinhas durante os primeiros 100 s, entre t = 0 s e t = 99 s, a fim de acessar a fluorescência de fundo.
nota: Os LUVs sozinhos também podem ser medidos durante todo o experimento (15 min) para acessar a fluorescência de fundo e possíveis vazamentos.
- Depois disso, meça o vazamento como um aumento na intensidade de fluorescência após a adição de alíquotas de solução peptídica pelos próximos 900 s (15 min). Este protocolo é realizado para cada concentração de peptídeo testada de 0,1 μM a 2,5 μM.
- Finalmente, 100% de fluorescência foi alcançada solubilizando os LUVs pela adição de 1 μL de Triton X-100 (0,1%, v / v), resultando na sonda completamente não extinta entre t = 1.000 s e t = 1.100 s.
7. Quantificação da fuga
- Suprimir os valores obtidos após t = 1.090 s para manter o mesmo número de pontos para cada condição testada.
- Calcule a fluorescência mínima, Fmin, fazendo a média de 50 pontos entre t = 0 s e t = 49 s (LUVs sozinhos).
- Calcule a fluorescência máxima, Fmax, fazendo a média de 50 pontos entre t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUVs com Triton X-100).
- Calcule a porcentagem de vazamento (%Vazamento) em cada ponto de tempo (t = x), de acordo com a seguinte equação:
%Vazamento(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Calcule a média e o desvio-padrão para valores obtidos com diferentes preparações LUV (n ≥ 2) para a mesma condição.
- Plote a porcentagem de vazamento, %Leak(t=x), em função do tempo (s).
