1. Coleta e Processamento de Plantas
- Coletar e processar amostras de plantas
- Depois de coletar amostras de plantas, congele rapidamente as amostras mergulhando o material vegetal em nitrogênio líquido com uma pinça e armazene a -80 °C. Se as amostras de plantas coletadas forem muito grandes para congelar rapidamente, resfrie rapidamente as amostras usando gelo seco e transfira para um freezer a -80 ° C o mais rápido possível. O teor de macronutrientes do material vegetal pode mudar após a separação dos tecidos da planta, por isso é importante congelar as amostras da planta o mais rápido possível após a coleta.
CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras graves quando em contato com a pele. Certifique-se de transportar nitrogênio líquido em recipientes aprovados e usar EPI adequado durante o manuseio, incluindo luvas criogênicas, óculos de proteção, protetor facial, avental e jaleco.
- Liofiliza o material vegetal usando um liofilizador para garantir que os tecidos estejam metabolicamente inativos enquanto a água está sendo removida. Seque até que a massa da amostra se estabilize para garantir que toda a água foi removida.
- Quando as amostras estiverem secas, triture até formar um pó fino usando um moedor ou moinho. Armazene as amostras em um gabinete de dessecação até a análise.
2. Ensaio de Proteína Solúvel
- Preparação de amostras
- Pese amostras replicadas de cada tecido, aproximadamente 20 mg cada, em tubos de microcentrífuga de poliestireno de 1,5 mL e tubos de etiqueta. Essas amostras serão posteriormente chamadas de amostras desconhecidas. Registre a massa exata de cada amostra, pois essas informações serão necessárias para calcular a proteína % solúvel em cada amostra desconhecida. Use tubos de microcentrífuga com tampas de travamento, pois as tampas sem travamento podem abrir durante a etapa de aquecimento subsequente, resultando na perda da solução de amostra.
- Solubilizar e isolar proteínas de amostra desconhecidas
- Usando um micropipetador, adicione 500 μL de NaOH 0,1 M a cada tubo. Feche bem as pálpebras e sonice por 30 minutos. Pré-aqueça um banho-maria quente a 90 °C.
CUIDADO: O hidróxido de sódio é uma base forte e pode causar queimaduras quando em contato com a pele. Embora o NaOH 0,1 M represente uma concentração baixa, use luvas de proteção para evitar irritação da pele.
- Coloque os tubos em uma grade em banho-maria quente por 15 minutos.
- Tubos de centrífuga a 15.000 x g por 10 minutos. Pipete o líquido sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga marcados, usando uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Adicione 300 μL de NaOH 0,1 M ao tubo que contém o pellet e centrifugue novamente a 15.000 x g por 10 minutos. Novamente, colete o líquido sobrenadante e combine-o com o outro fluido sobrenadante da mesma amostra. Este é um ponto de parada potencial e as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite, se necessário.
- Precipitar proteínas vegetais
- Neutralize o pH da solução sobrenadante adicionando 11 μL de HCl 5,8 M. Confirme um pH de ~ 7 mergulhando papel de tornassol em cada solução de amostra.
CUIDADO: O ácido clorídrico é um ácido corrosivo forte que pode causar queimaduras quando em contato com a pele (aplicação ou inalação pela pele). Use luvas para evitar irritação da pele durante o manuseio do HCl.
- Adicione 90 μL de ácido tricloroacético (TCA) a 100% a cada tubo e incube os tubos no gelo por 30 minutos. A precipitação de proteínas transformará a solução de clara em opaca. Se isso não ocorrer após 30 minutos, leve os tubos à geladeira por 1 hora. Este é um ponto de parada potencial, e as amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite, se necessário.
CUIDADO: O ácido tricloroacético é corrosivo. Use luvas ao manusear para evitar o contato com a pele e evitar a inalação.
- Centrifugue as amostras a 13.000 x g por 10 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante do TCA, aspirando-o usando uma linha de vácuo conectada a uma ponta de micropipeta de vidro fino (a mesma ponta pode ser usada em todas as amostras). Não perturbe o pellet de proteína evitando sucção pesada e mantendo uma distância adequada entre a ponta da pipeta e o pellet.
- Lave o pellet rapidamente com 100 μL de acetona a -20 °C. Esta etapa remove qualquer TCA remanescente do pellet, o que pode interferir no ensaio de Bradford subsequente; No entanto, a acetona começará a dissolver o pellet de proteína se for deixada em contato por muito tempo, portanto, a acetona deve ser adicionada e extraída rapidamente do pellet em 5 segundos.
- Deixe a acetona evaporar colocando os tubos em uma capela ou geladeira. Em seguida, dissolva o pellet de proteína adicionando 1 mL de NaOH 0,1 M a cada tubo. A dissolução total do pellet pode exigir várias rodadas de aquecimento em banho-maria, vórtice e sonicação.
NOTA: Quanto mais tempo os tubos ficarem na hotte ou no frigorífico e quanto mais secos os pellets ficarem, mais difícil será a sua resolubilidade. Sugere-se secar o pellet por 30 minutos e, em seguida, verificar a presença de acetona a cada 10-15 minutos até que esteja claro que a acetona evaporou (não são detectáveis vapores de acetona).
- Misture soluções-padrão, dilua soluções de amostras desconhecidas e quantifique o teor total de proteínas de amostras desconhecidas usando o ensaio de Bradford.
- Preparar soluções-padrão de imunoglobulina G (IgG) bovina de acordo com as concentrações indicadas no quadro 1 (a solução-mãe liofilizada ou de IgG pode ser misturada com água desionizada para atingir cada concentração). Armazene os padrões a 4 °C. Em uma placa de 96 poços, adicione 160 μL de cada solução padrão de IgG em triplicata começando na posição A1 da placa do poço (0 μg/μL na posição A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL nas posições B1, B2, B3, etc.).
- Prepare uma solução diluída de NaOH adicionando 50 μL de NaOH 0,1 M a 950 μL de água destilada. Como controle negativo em branco, adicione 60 μL desta solução à placa do poço em triplicado (posições G1, G2, G3).
- Prepare diluições de amostras desconhecidas adicionando 50 μL de cada solução de amostra a 950 μL de água destilada em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, adicionar 60 μL de cada amostra diluída à placa do poço em triplicata, começando na posição H1. Uma placa de 96 poços deve permitir a análise de 6 padrões, 1 branco e 25 amostras desconhecidas quando lidas em triplicado. Cada placa de poço analisada deve conter seu próprio padrão de IgG e amostras em branco.
- Adicione 100 μL de água destilada a todos os poços de amostras em branco e desconhecidos. Agora, cada poço deve conter um total de 160 μL. Usando uma pipeta multicanal (8 canais), adicione 40 μL de corante de proteína G-250 azul brilhante Coomassie a cada poço na primeira coluna da placa do poço. Misture o corante com as amostras mergulhando várias vezes. Repita para todas as outras colunas, substituindo as ponteiras da pipeta para evitar contaminação.
CUIDADO: O azul brilhante Coomassie G-250 é irritante e o contato com a pele, olhos ou pulmões deve ser evitado. Por favor, use luvas para evitar o contato com a pele. Se ocorrer contato com a pele, este produto irá manchar.
- Use uma agulha para estourar quaisquer bolhas presentes nos poços, pois elas podem interferir na leitura do espectrofotômetro de microplacas. Limpe a agulha para evitar contaminação entre os poços. Deixe a microplaca incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Usando um espectrofotômetro de microplacas, registre os valores de absorbância para cada poço em 595 nm.
Tabela 1. Cálculos de curva padrão para o ensaio de proteína solúvel.A quantidade de proteína em cada padrão é calculada tomando a concentração de cada padrão e multiplicando-a pela quantidade de solução padrão em cada poço (160 μL).
| Concentração de IgG (μg/μL) | Proteína em Amostras-Padrão (μg) |
| 0,0000 | 0 |
| 0,0125 | algarismo |
| 0,0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0,0500 | 8 |
| 0,1000 | 16 |
