Ensaio Colorimétrico para a Quantificação de Carboidratos Não Estruturais em Tecidos Vegetais

Resumo

Fonte: Deans, C. A. et al. Quantificando a proteína solúvel vegetal e o teor de carboidratos digeríveis, usando milho (Zea mays) como exemplo. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve o método para quantificar os carboidratos digeríveis presentes nos tecidos vegetais. Isso ajuda a coletar dados de vários tecidos vegetais para estudar a ecologia nutricional, as interações planta-herbívoro e a dinâmica da teia alimentar.

Protocolo

1. Coleta e Processamento de Plantas

1. Depois de coletar amostras de plantas, congele rapidamente as amostras mergulhando o material vegetal em nitrogênio líquido com uma pinça e armazene a -80 °C. Se as amostras de plantas coletadas forem muito grandes para congelar rapidamente, resfrie rapidamente as amostras usando gelo seco e transfira para um freezer a -80 ° C o mais rápido possível. O teor de macronutrientes do material vegetal pode mudar após a separação dos tecidos da planta, por isso é importante congelar as amostras da planta o mais rápido possível após a coleta.
   cuidado: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras graves quando em contato com a pele. Certifique-se de transportar nitrogênio líquido em recipientes aprovados e usar EPI adequado durante o manuseio, incluindo luvas criogênicas, óculos de proteção, protetor facial, avental e jaleco.
2. Liofiliza o material vegetal usando um liofilizador para garantir que os tecidos estejam metabolicamente inativos enquanto a água está sendo removida. Seque até que a massa da amostra se estabilize para garantir que toda a água foi removida.
3. Quando as amostras estiverem secas, triture até formar um pó fino usando um moedor ou moinho. Armazene as amostras em um gabinete de dessecação até a análise.

2. Ensaio de Carboidratos Digeríveis

1. Preparação de amostras
   1. Pesar amostras replicadas de cada tecido, aproximadamente 20 mg cada, em tubos de vidro de 15 ml com tampas de rosca revestidas de borracha (100 mm de comprimento). Essas amostras serão posteriormente chamadas de amostras desconhecidas. Rotule os tubos com um marcador à prova d'água ou com fita adesiva nas tampas e registre a massa exata de cada amostra, pois essas informações serão necessárias para calcular os %carboidratos em cada amostra desconhecida.
2. Extraia carboidratos digeríveis de cada amostra desconhecida.
   1. Adicione 1 mL de 0,1 M H₂SO₄ a cada tubo e aperte bem as tampas nos tubos. Coloque em banho-maria fervente por 1 hora.
      cuidado: O ácido sulfúrico é muito corrosivo. Use luvas, óculos de proteção e avental ao manusear H₂SO₄ e execute esta etapa em uma hotte.
   2. Resfrie os tubos em banho-maria morno. Despeje o conteúdo do tubo em tubos de microcentrífuga de 1.5 mL rotulados (não se preocupe se algum material vegetal permanecer nos tubos de vidro).
   3. Tubos de centrífuga a 15.000 x g por 10 minutos. Remova o líquido sobrenadante com um micropipetador e coloque em novos tubos de microcentrífuga rotulados de 1,5 mL. Os tubos podem ser refrigerados durante a noite neste momento. Se continuar com o ensaio, consulte a etapa 2.3.2.
3. Misturar soluções-padrão e quantificar o teor total de hidratos de carbono digeríveis de amostras desconhecidas.
   1. Preparar soluções-padrão de glicose D(+) com as concentrações indicadas no quadro 1. Preparar seis tubos de ensaio de vidro com 400 μL de cada solução-padrão.
   2. Pipete 15 μL de cada amostra desconhecida em seu próprio tubo de ensaio e adicione 385 μL de água destilada a cada um para um volume total de 400 μL em cada tubo de ensaio. Em uma capela de exaustão, adicione 400 μL de fenol a 5% a cada tubo de ensaio de amostra padrão e desconhecido e, em seguida, pipete rapidamente 2 mL de H₂SO₄ concentrado em cada tubo. Não toque no conteúdo do tubo de ensaio com a ponta da pipeta, apenas adicione à superfície da solução (uma pipeta repetidora funciona melhor para isso).
   3. Deixe os tubos incubarem por 10 minutos e, em seguida, bata cuidadosamente os tubos para misturar o conteúdo. Incube por mais 30 minutos.
      cuidado: O fenol e o ácido sulfúrico são irritantes corrosivos. Para proteger da exposição à pele, olhos e inalação, esta etapa deve ser realizada em uma capela de exaustão química usando o EPI adequado, que inclui: protetor facial ou óculos de proteção, luvas de borracha, avental de laboratório e botas. A mistura de fenol com ácido sulfúrico também resulta em uma reação exotérmica, que resultará no aquecimento dos tubos.
   4. Pipetar 800 μL de amostra de cada tubo em cada uma das 3 cubetas semimicromicro de poliestireno de 1,5 mL (3 réplicas técnicas por amostra). Defina o espectrofotómetro para ler a 490 nm. Calibre para uma cubeta em branco contendo água destilada antes de ler padrões ou amostras desconhecidas e intermitentemente durante as leituras de amostras. Passe cada cubeta por um espectrofotômetro e registre a absorbância. Média entre réplicas técnicas para cada amostra desconhecida.
      nota: Em alguns casos, as amostras podem ultrapassar o limite superior de absorbância. Em caso afirmativo, as amostras devem ser diluídas na etapa 1.3.1. As diluições também devem ser contabilizadas em cálculos subsequentes.
   5. Calcule a absorbância média para cada padrão.
      nota: Para calcular a quantidade de carboidratos digestíveis totais presentes em cada amostra desconhecida usando a curva padrão, é mais fácil regredir a absorbância média de cada padrão em relação aos microgramas de D(+)glicose presentes em cada padrão, mas também pode-se plotar a concentração de D(+)glicose (μg/μL) de cada padrão, se desejável. Os cálculos a seguir, no entanto, referem-se a uma curva padrão baseada em microgramas, não em concentrações (μg/μL).
   6. Calcular a curva-padrão traçando a absorbância média em relação à quantidade total de D(+)glucose (μg) em cada solução-padrão. Ajuste uma linha de regressão linear a esses dados e, em seguida, use a seguinte equação para calcular a quantidade total de carboidratos (μg) em cada amostra desconhecida:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg de carboidratos na amostra
      A_x = absorbância média da amostra desconhecida
      B = intercepto Y (linha de regressão padrão)
      m = inclinação (reta de regressão padrão)
      O coeficiente de correlação desta linha deve ser maior que 0,98 e rotineiramente próximo a 0,99. Em seguida, use a seguinte equação para determinar a porcentagem de carboidratos em cada amostra:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%carboidratos
      M_i = massa inicial da amostra (mg)

Tabela 1. Cálculo da curva padrão para o ensaio de carboidratos digestíveis. A quantidade de glicose em cada padrão é calculada tomando a concentração de cada padrão e multiplicando-a pela quantidade de solução-padrão em cada tubo de ensaio (400 μL)

Concentração de glicose D (+) (ug / uL)	D(+)glicose em Amostras Padrão (ug)
0,0000	0
0,0375	15
0.0750	30
0,1125	45
0,1500	60
0,1875	75

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Leitor de microplacas (espectrofotômetro)	Modelo Bio-Rad	680 XR