Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Ensaio de crescimento de Toxoplasma baseado em luciferase
- Semeie fibroblastos de prepúcio humano (HFFs) 1 semana antes da inoculação do parasita para garantir que as células hospedeiras sejam totalmente confluentes. Realizar um ensaio simulado em uma placa transparente para garantir que os parasitas permaneçam intracelulares durante todo o período de avaliação.
nota: Aqui, o ensaio é realizado em microplacas de 96 poços. De acordo com as necessidades experimentais, pode ser dimensionado para microplacas de 384 ou 1536 poços.
- Passe os parasitas do Toxoplasma para HFFs confluentes 2 dias antes do uso, transferindo ~ 0,3-0,4 mL de parasitas totalmente lisados para um frasco T25. Incubar as células hospedeiras infectadas a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 dias.
- Seringa 5 mL de parasitas recém-lisados através de uma agulha de segurança de 21 G 5x para liberar parasitas intracelulares e, em seguida, passe por um filtro de 3 μm para remover os detritos da célula hospedeira. Enxágue os parasitas residuais do frasco usando 7 mL de meio D10 sem vermelho de fenol e passe novamente pelo filtro.
- Centrifugue os parasitas a 1000 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT). Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de meio D10 sem vermelho de fenol.
- Conte os parasitas usando um hemocitômetro para determinar a concentração.
- Dilua os parasitas para 1 x 104 parasitas / mL para a cepa do tipo selvagem (WT). Para cepas de parasitas com deficiência de crescimento, aumente a concentração de acordo para observar um aumento significativo nos sinais de luciferase.
- Aspirar cuidadosamente o meio de 96 microplacas de poço pré-semeadas com HFFs e inocular 150 μL de ressuspensão do parasita em poços em um formato de três colunas e cinco linhas, o que representa três réplicas técnicas e cinco pontos de tempo.
- Incubar a microplaca a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 h.
- Aspire cuidadosamente o meio dos poços para remover parasitas não invadidos e, em seguida, encha os alvéolos com meio livre de vermelho de fenol RT em cada fileira (exceto na primeira fileira).
- Misture volumes iguais de PBS e tampão de ensaio de luciferase 2x e dilua o substrato de luciferase a 12,5 μM.
- Adicione 100 μL de substrato de luciferase diluído em cada poço da linha superior. Incube as microplacas em RT por 10 min para permitir que as células se lisem completamente.
- Meça a atividade da luciferase usando um leitor de microplacas. As configurações do leitor de placas estão listadas na Tabela 1. Cada leitura representa o número inicial de parasitas invadidos 4 h após a infecção.
- Repita os passos 1.9-1.12 para cada linha a cada 24 h por 4 dias sem alterar o meio. Essas leituras refletem o número total de parasitas replicados em 24 h, 48 h, 72 h e 96 h pós-infecção.
- Calcule as leituras médias em cada ponto de tempo e divida-as pelas leituras médias em 4 h para determinar as mudanças nas dobras no crescimento do parasita ao longo do tempo.
- Plote os dados usando software gráfico.
- Para calcular o tempo de duplicação, plote os valores log2 das alterações de dobra nos pontos de tempo individuais durante o tempo de incubação. Use uma função de regressão linear para calcular a inclinação, que representa o tempo de duplicação de cada deformação.
Tabela 1: Configurações do leitor de microplacas para medição da atividade da luciferase durante o ensaio de crescimento de Toxoplasma baseado em luciferase
| Luciferase: | Extremidade |
| Tempo de integração: | 1 s |
| Conjunto de filtros - Emissão: | Luz total |
| óptica: | Início |
| ganhar: | 135 |
| Velocidade de leitura: | normal |
| atraso: | 100 ms |
| Altura de leitura: | 4,5 milímetros |
