Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Avaliação da eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento de Toxoplasma
NOTA: Aqui, a avaliação da inibição do LHVS no crescimento de Toxoplasma é apresentada como exemplo. Oito concentrações diferentes de LHVS são testadas e três repetições técnicas são realizadas para cada uma das três réplicas biológicas para as cepas RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::NLuc.
- Antes da infecção do parasita, semeie HFFs em microplacas de 96 poços no formato de três linhas e nove colunas para uma réplica biológica por composto por cepa. As células hospedeiras poderão crescer por pelo menos 7 dias antes do uso.
- Passe os parasitas RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::NLuc por 2 dias antes do uso.
- Passe os parasitas do Toxoplasma para HFFs confluentes 2 dias antes do uso, transferindo ~ 0,3-0,4 mL de parasitas totalmente lisados para um frasco T25. Incubar as células hospedeiras infectadas a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 dias.
- Seringa 5 mL de parasitas recém-lisados através de uma agulha de segurança de 21 G 5x para liberar parasitas intracelulares e, em seguida, passe por um filtro de 3 μm para remover os detritos da célula hospedeira. Enxágue os parasitas residuais do frasco usando 7 mL de meio D10 sem vermelho de fenol e passe novamente pelo filtro.
- Centrifugue os parasitas a 1000 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT). Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de meio D10 sem vermelho de fenol.
- Conte os parasitas usando um hemocitômetro para determinar a concentração.
- Dilua os parasitas para 1 x 104 parasitas / mL para a cepa do tipo selvagem (WT). Para cepas de parasitas com deficiência de crescimento, aumente a concentração de acordo para observar um aumento significativo nos sinais de luciferase.
- Ressuspenda os parasitas em meio livre de vermelho de fenol a 1 x 104 parasitas / mL.
- Aspirar o meio de uma placa contendo HFFs confluentes e inocular cada poço com 150 μL de ressuspensão do parasita. Incubar a microplaca a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 h.
- Preparar o LHVS em oito concentrações diferentes num reservatório de 12 poços por diluição em série. Geralmente, as concentrações são reduzidas em três vezes de forma de diluição seriada.
nota: A concentração mais baixa é reduzida em 6.561 vezes em relação à concentração mais alta. A mudança de dobra da diluição pode ser ajustada de acordo com as diferentes propriedades de compostos individuais.
- Às 4 h pós-infecção, aspire o meio para remover os parasitas não invadidos e preencha cada poço das colunas 2-9 com 150 μL de meio suplementado com LHVS em diferentes concentrações. Deixe a primeira coluna cheia de meio regular para servir como um controle não tratado.
- Incubar a microplaca a 37 °C e 5% de CO2 durante mais 96 h.
- Aspire cuidadosamente o meio dos poços para remover parasitas não invadidos e, em seguida, encha os alvéolos com meio livre de vermelho de fenol RT em cada fileira (exceto na primeira fileira).
- Misture volumes iguais de PBS e tampão de ensaio de luciferase 2x e dilua o substrato de luciferase a 12,5 μM.
- Adicione 100 μL de substrato de luciferase diluído em cada poço da linha superior. Incube as microplacas em RT por 10 min para permitir que as células se lisem completamente.
- Meça a atividade da luciferase de poços individuais.
- Calcule a média das atividades de luciferase de três réplicas técnicas de poços de cada concentração individual de LHVS.
- Divida a atividade média da luciferase para cada concentração de LHVS pela atividade média da luciferase derivada de parasitas não tratados para calcular a atividade normalizada da luciferase como uma porcentagem.
- Plote as atividades normalizadas da luciferase em relação às concentrações individuais de LHVS usando software gráfico (Figura 1). A inibição da pirimetamina contra o crescimento do parasita também é medida como controle. A pirimetamina é um antibiótico clínico usado para tratar a toxoplasmose aguda, inibindo o metabolismo do ácido fólico no Toxoplasma.
- Calcule os valores de IC50 para compostos individuais usando o método incorporado no software gráfico, resposta normalizada vs. [inibidor], sob o programa de regressão "dose-resposta-inibição". O IC50 é calculado usando a seguinte fórmula:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Onde: Y representa as atividades normalizadas da luciferase das células infectadas sob diferentes concentrações de inibidor e X representa concentrações individuais de inibidor.
