Ensaio de extração de msp1 para estudar a remoção de proteínas TA mal localizadas

Resumo

Fonte: Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um protocolo in vitro para estudar a remoção mediada por Msp1 de proteínas TA mal localizadas integradas à bicamada lipídica de lipossomas. As proteínas Msp1 e TA são co-reconstituídas em lipossomas, e a translocação dependente de ATP das proteínas TA é confirmada por meio da purificação de afinidade.

Protocolo

1. Preparação de lipossomas

1. Combine os estoques de clorofórmio de lipídios em proporções apropriadas para imitar a membrana mitocondrial externa.
   1. Prepare 25 mg de mistura lipídica. Usamos uma mistura previamente estabelecida de lipídios que imitam as membranas mitocondriais, consistindo em uma proporção molar de 48:28:10:10:4 de fosfatidilcolina de ovo de galinha (PC), fosfatidiletanolamina de ovo de galinha (PE), fosfatidil inositol de fígado bovino (PI), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina sintética (DOPS) e 1',3'-bis [1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol sintético (TOCL). Os cálculos de amostra são mostrados na Tabela 1

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioesferas	Bio-Rad	1523920
Fosfatidilinositol de fígado bovino	Avanti	840042C	pi
Fosfatidilcolina de ovo de galinha	Avanti	840051C	computador pessoal
Fosfatidiletanolamina de ovo de galinha	Avanti	840021C	Pe
Suportes de filtro	Avanti	610014
Frasco de vidro	VWR	60910L-1
Coluna de rotação de glutationa	Thermo Fisher	PI16103
Mini-Extrusora	Avanti	Nº 610020
Sintético 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina	Avanti	840035C	DOPS
1', 3'-bis[12-dioleoil-snglicero-3-fosfo]glicerol sintético	Avanti	710335C	TOCL
Seringa 1 mL	Norma-Ject 53548-001
Seringa 1 mL estanque a gás	Avanti 610017