1. Ensaio de β-galactosidase
NOTA: A quantificação da atividade da β-galactosidase é usada como uma forma indireta de determinar o número de parasitas. Espera-se que o crescimento seja inibido na presença de um composto tripanocida, levando a um menor número de parasitas em comparação com o controle não tratado, o que se refletirá em uma menor atividade de β-galactosidase e, portanto, menor absorbância.
- Incube os parasitas com BZN
- Adicione 100 μL de solução 2x benznidazol (BZN) correspondente por poço para atingir uma concentração final de BZN de 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 μM a 100 μL de suspensão epimastigota, células Vero com amastigotas (2 dias após a infecção) ou tripomastigotas em uma placa de 96 poços.
- Incubar os epimastigotas a 28 °C por 72 h, e os tripomastigotas ou células Vero infectadas com amastigotas por 24 h a 37 °C e 5% de CO₂.
nota: Cada concentração de droga deve ser avaliada pelo menos em triplicata e incluir culturas controle de epimastigotas, tripomastigotas e células Vero infectadas com dimetilsulfóxido (DMSO).
- Reação colorimétrica
- Após o período de incubação do tratamento, se as células Vero ou tripomastigotas infectadas estiverem no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com vermelho de fenol, substitua o meio por 100 μL de 1x PBS para evitar interferência. Execute poços em branco triplicados contendo apenas 100 μL do meio correspondente (ou 1x PBS, conforme apropriado).
nota: Não é necessário remover o meio de cultura para epimastigotas no caso de meio LIT ou DMEM sem vermelho de fenol. DMEM com vermelho de fenol ainda pode ser usado; preparar um poço em branco apenas com DMEM para medir a absorbância da base e, em seguida, subtrair esse valor durante a análise dos dados. O meio inseto de Schneider, que é incolor, é uma alternativa para epimastigotas.
- Adicionar 40 μL de solução de substrato de vermelho de clorofenol β-D-galactopiranosídeo (CPRG) e 10 μL da solução detergente a cada poço, obtendo-se uma concentração final de 200 μM de CPRG e 0,1% de detergente em um volume final de 250 μL em cada poço.
nota: A solução de CPRG e o detergente podem ser adicionados em um volume final de 50 μL por poço.
- Incubar a 37 °C durante 2 h e medir a absorvância a 595 nm num espectrofotómetro de microplacas.
nota: A mudança de cor esperada é de amarelo a marrom-avermelhado após a clivagem enzimática da β-galactosidase (Figura 1A). O tempo de incubação pode ser estendido até 4 h, e os espectros de absorbância do vermelho de clorofenol podem ser lidos entre 570 e 595 nm com ajuste de curva semelhante. A incubação por até 24 h na presença de substrato CPRG mostrou ajustes de curva semelhantes.
