Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Liberação de monoamina endógena ex-vivo de fatias ou socos cerebrais
NOTA: O dispositivo usado para esta seção consiste em uma placa de 48 poços e um suporte de tecido feito de seis unidades de filtro de microcentrífuga sem os filtros inseridos conectados a uma linha de carbogênio (Figura 1). Para fazer o suporte, use uma haste de plástico resistente (por exemplo, de um raspador de células) e cole as unidades de filtro de microcentrífuga sem os filtros embutidos. Deixe secar por 1-2 dias. O tempo necessário para o experimento de liberação de monoamina endógena e as concentrações de anfetamina, fluoxetina e cocaína são baseados na literatura atual e em protocolos anteriores.
- Ativação tecidual
- Transfira o tecido cerebral para cada poço da câmara de efluxo e permita a recuperação por 30-50 min a 37 ° C em um aquecedor de lâminas em 0,5-1 mL de tampão de efluxo oxigenado, com borbulhamento constante e suave ( Figura 1B1 ).
- Durante esta incubação, diluir os fármacos até à concentração desejada para a experiência. Todos os medicamentos devem ser dissolvidos em tampão de efluxo e as concentrações são baseadas na literatura atual.
- Primeira incubação
- Mova o suporte de tecido com tecido cerebral para poços contendo 500 μL de tampão de efluxo oxigenado e incube por 20 min a 37 ° C. Certifique-se de que o mínimo ou nenhum tampão seja transportado batendo no suporte na borda do poço até que nenhum excesso de tampão esteja no suporte.
- Em experimentos com agentes farmacológicos, como inibidores do transportador de monoamina, incube as amostras de tecido com as drogas diluídas em tampão de efluxo oxigenado (por exemplo, 10 μM de fluoxetina, 40 μM de cocaína; ver Figura 1B2). O volume final em cada poço será de 500 μL.
- Segunda incubação
- Mova o suporte com o tecido para um novo conjunto de poços contendo 500 μL de tampão de efluxo total com ou sem a concentração desejada de cada medicamento. Certifique-se de que não haja excesso de buffer. Cada poço representa um n = 1 para condições experimentais. Cada condição experimental é realizada em triplicata.
- Um poço inclui um tampão de efluxo oxigenado, o próximo 10-30 μM AMPH e o poço final inclui 10-30 μM AMPH mais inibidores do transportador de monoamina. Cada droga é dissolvida em tampão de efluxo oxigenado.
- Incubar o tecido por 20 min a 37 °C com 500 μL da condição do medicamento.
nota: Poços adicionais podem incluir um tampão de efluxo oxigenado de alto K+ com ou sem os inibidores do transportador de monoamina. Dissolva cada medicamento no tampão de efluxo oxigenado (500 μL).
- Durante esta segunda incubação de 20 min, coletar a solução dos poços da primeira incubação na etapa 1.2.1 e transferir para tubos de microcentrífuga contendo 50 μL de ácido perclórico 1 N ou ácido fosfórico (dependendo do tipo de HPLC, concentração final de 0,1 N). O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha os tubos de microcentrífuga no gelo e rotule os tubos #1.
- Após a segunda incubação de 20 min, mova o suporte de tecido com seções cerebrais ou punções para um poço vazio e mantenha a placa no gelo. Transferir o sobrenadante para tubos de microcentrífuga contendo 50 μL de ácido perclórico 1 N ou ácido fosfórico. O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha os tubos de microcentrífuga no gelo e rotule os tubos #2.
- Adicione 1 mL de tampão de dissecção gelado a cada poço contendo tecido. Colete todo o tecido usando uma pinça pequena e transfira para tubos de microcentrífuga limpos.
- Mantenha os tubos com tecido cerebral a -80 °C. Descarte o 1 mL de tampão de dissecção ( Figura 1B4 ).
- Soluções filtrantes obtidas de cada incubação usando tubos filtrantes de microcentrífuga (0,22 μm) a 2.500 x g por 2min. Use o filtrado para determinar o teor de monoamina usando HPLC com detecção eletroquímica (Figura 1B5).
