Todos os procedimentos em animais descritos aqui foram aprovados pelo núcleo institucional e comitê de uso da Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai.
1. Preparação antes do isolamento de células valvares de camundongos adultos
- Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A usando etanol v / v a 70% e, posteriormente, autoclavando-os por 30 min. Limpe o espaço cirúrgico com etanol a 70%.
- Adicione 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare uma alíquota de 50 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha as soluções no gelo.
- Prepare soluções de colagenase de 1 mg/mL e 4,5 mg/mL e use 5 mL de cada solução em tubos de 15 mL para realizar todo o procedimento. Para preparar 5 mL de colagenase 1 mg / mL, misture 5 mg de colagenase com 2,5 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, sem soro fetal bovino (FBS)) e 2,5 mL de HEPES 10 mM suplementado com antibióticos (penicilina-estreptomicina a 1% da etapa 1.2). Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação.
NOTA: Mantenha as soluções no gelo para proteger as enzimas.
- Aqueça a solução DMEM a 37 °C antes de usar em todas as etapas descritas abaixo. Prepare o meio completo suplementando o DMEM com 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de piruvato de sódio, 5 mL de 200 mM de L-glutamina, 1 mL de reagente de eliminação de micoplasma (consulte a Tabela de Materiais) e 10% de FBS.
2. Isolamento de células valvares
- Para obter 105 células para o experimento, use cinco camundongos de 8 semanas (mínimo de três). Coloque o camundongo em uma câmara de indução junto com um pequeno pedaço de papel de seda embebido em 1 mL de isoflurano, mas não permita o contato com o tecido. Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado; Verifique o reflexo de pinça do dedo do pé e, em seguida, eutanasiar o mouse por luxação cervical. Use isoflurano para aliviar qualquer dor antes da luxação cervical, pois o procedimento descrito abaixo é terminal.
- Coloque o mouse em uma plataforma de dissecação e fixe as patas com cânulas para mantê-lo no lugar. Limpe o tórax e o abdômen com etanol; Abra o abdômen e o peito com uma tesoura. Com uma pequena tesoura cirúrgica, corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo para exsanguinar o camundongo. Perfunda o coração com 10 mL de frio 1x PBS para remover o sangue do coração.
- Corte o coração e mantenha 3 mm da aorta ascendente, conforme mostrado na Figura 1B. Dissecar a válvula aórtica sob um estereomicroscópio. Corte o coração horizontalmente no meio dos ventrículos (Figura 1C). Corte o ventrículo esquerdo em direção à aorta e disseque cuidadosamente a válvula aórtica (Figura 1D-F). Agrupar as válvulas numa pequena placa de cultura de tecidos de 35 mm.
- Lavar as válvulas isoladas em uma placa de cultura de células de 75 mm com 5 mL de HEPES frio (10 mM) suplementado com antibióticos (penicilina-estreptomicina a 1%) para remoção de sangue (Figura 2). Prepare dois tubos de 15 mL de colagenase 1 mg/mL e 4,5 mg/mL conforme descrito acima na etapa 1.3.
nota: Após a dissecção, manipule as válvulas isoladas em uma capa de biossegurança estéril para minimizar a contaminação.
- Incubar as válvulas em colagenase tipo I (1 mg/mL) por 30 min a 37 °C com agitação contínua (Figura 2). Centrifugue o tubo por 5 min a 150 × g, lave o pellet uma vez com 2 mL de HEPES (10 mM) e vortex por 30 s em alta velocidade. Despeje o conteúdo deste tubo em uma placa de cultura de 35 mm e transfira cuidadosamente os fragmentos de tecido usando uma pinça fina para um novo tubo.
nota: Nesta fase, os VICs ainda não estão dissociados do tecido e o pellet contém pedaços de tecido. Para evitar a contaminação com células endoteliais, não centrifugue após o vórtice na etapa 2.5.
- Incube o pellet em um tubo de 15 mL com 5 mL de colagenase tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C sob agitação contínua por 35 min. Ressuspenda as células com uma pipeta de 1 mL para separar as células e centrifugue a 150 × g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de DMEM completo. Centrifugue a 150 × g por 5 min a 4 °C. Repita esta etapa duas vezes para limpar as células.
nota: O pellet ainda terá alguns fragmentos de tecido.
- Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo e coloque as células em um poço de uma placa de cultura de células de 6 poços em uma quantidade mínima de meio para facilitar sua fixação à placa de cultura. Deixar as células, sem perturbações, numa incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono.
- Após 3 dias, verifique as células ao microscópio para verificar um bom crescimento próximo aos detritos do tecido. Quando 1.000 células estiverem visíveis ao microscópio, remova cuidadosamente os detritos do tecido com uma pinça autoclavada e troque o meio.
nota: A placa não deve ser mexida; Se o número necessário de células não for observado, coloque a placa de cultura de células de volta na incubadora por mais 2 dias.
- Quando as células estiverem 70% confluentes (2,5 × 105), tripsinize e transfira-as para uma placa de cultura de tecidos de 75 mm.
3. Ensaio de calcificação in vitro
- Limpar o exaustor com etanol a 70%, aquecer o meio DMEM a 37 °C.
- Semeie 100.000 células/condição em placas de 6 poços em DMEM completo e cultive por 24 h a 37 °C.
- Prepare o meio calcificante misturando 2 mM de NaH2PO4, insulina 10-7 M e 50 μg/mL de ácido ascórbico em DMEM com 5% de FBS. Para 93 mL de DMEM, adicionar 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentração final de 1%), 1 mL de piruvato de sódio (100 mM), 27,5 mg de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina e 5 mg de ácido ascórbico.
NOTA: Filtre a solução usando um filtro de 0.22 μm antes de usar.
- Após 24 h, substitua o meio sobrenadante pelo meio calcificante. Incubar as células durante 7 dias a 37 °C. No 3º dia, substitua por meio calcificante fresco e coloque a placa de volta na incubadora para completar os 7 dias de tratamento.
- Após 7 dias, remova o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS. Incubar as células em 1 ml de ácido clorídrico (HCl) 0,6 N durante 24 h a 37 °C. Recolher o HCl num tubo de 1,5 ml e evaporá-lo num evaporador rotativo. Ressuspender o conteúdo de todos os tubos em 60 μL de HCl.
nota: O procedimento de secagem é importante para concentrar a solução e ter o mesmo volume para cada condição.
- Use uma placa de 96 poços para medir a concentração de cálcio usando o reagente Arsenazo III, disponível em um kit pronto para uso (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes).
- Prepare uma solução-padrão de cálcio na concentração de 10 mg/dL. Pesar 10 mg de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e dissolver em 100 ml de água destilada.
- Em uma placa transparente de 96 poços, pipete 2 μL de solução em branco (HCl, 0,6 N), a solução padrão, a amostra por poço (10 mg/dL) e as amostras. Realizar a experiência em triplicata para verificar a variabilidade da pipetagem. Adicione 200 μL do reagente para cada condição.
nota: Amostras acima de 15 mg/dL devem ser diluídas 1:1 com solução salina, reanalisadas e o resultado multiplicado por dois.
- Incube a reação por 15 min em temperatura ambiente.
nota: A reação é estável por 60 min.
- Leia e registre a absorbância da placa a 650 nm. Use a seguinte fórmula para calcular a quantidade de cálcio nas amostras:
Cálcio (mg/mL) = (Absorbância da amostra/Absorbância do padrão) × Concentração do padrão
