Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Amostragem de PM2.5 e extracção de compostos orgânicos
NOTA: PM2.5 foi coletado em uma área urbana em Suzhou, China, de 1 a 7 de agosto de 2015, conforme descrito anteriormente.
- Cozer filtros de membrana de quartzo de 47 mm numa mufla a 500 °C durante 2 h para remover os componentes orgânicos.
- Colocar um filtro num amostrador de PM2,5 durante 24 h de amostragem ininterrupta.
- Remova o filtro e seque por 24 h em temperatura ambiente.
- Quantificar o filtro com uma balança analítica.
- Extrair componentes orgânicos do filtro por extração de Soxhlet utilizando diclorometano como solvente.
- Secar o MOE por evaporação rotativa em banho-maria a 60 °C e fluxo de azoto. Dissolver o MOE em DMSO e conservar a -20 °C.
2. Coleta e tratamento de embriões de peixe-zebra
- Manter o peixe-zebra a 28,5 ± 0,5 °C num sistema de aquicultura de recirculação com um ciclo de fotoperíodo de 14 h de luz e 10 h de escuridão.
- Coloque o peixe-zebra adulto saudável em um tanque na proporção de 2:1 macho para fêmea.
- No dia seguinte, colete os embriões e lave-os com água do sistema (ou seja, água de reprodução do peixe-zebra).
- Selecione e divida aleatoriamente embriões de peixe-zebra que demonstrem um desenvolvimento normal (tamanho uniforme, grãos cheios e sem coagulação do ovo) em 4 grupos em placas de Petri de vidro individuais com um diâmetro de 7 cm (cerca de 50 embriões por prato).
- Trate os embriões com PM2,5 (5 mg / L) na presença ou ausência de NAC a 0,25 μM de 2 hpf até 72 hpf. Use DMSO como controle do veículo até uma concentração final de 0,1% (v/v).
3. Observação morfológica de embriões de peixe-zebra e dissecção cardíaca
- A 72 hpf, transfira os embriões para lâminas de vidro e observe ao microscópio estereoscópico. Registre malformações cardíacas, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho.
- Calcule as taxas de malformação (a porcentagem de embriões com defeitos cardíacos em relação ao total de embriões vivos) e analise as diferenças entre os grupos usando ANOVA de uma via seguida pelo Teste de Comparação Múltipla da Turquia (p < 0,05 = estatisticamente significativo).
- Anestesiar os embriões com 0,6 mg/mL MS-222 para imobilizá-los em lâminas de vidro.
- Registre batimentos cardíacos por 30 s e quantifique as frequências cardíacas usando o software ImageJ.
- Disseque corações de embriões de peixe-zebra com uma agulha de seringa descartável sob um microscópio estéreo. Cuidado: Evite destruir o formato do coração.
4. Ensaio de imunofluorescência
- Para usar um ensaio de imunofluorescência para detectar danos ao DNA induzidos por PM2.5 no coração de embriões de peixe-zebra, use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um lado de vidro limpo.
- Adicione 50 μL de paraformaldeído a 4% a 1,25 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para fazer uma solução fixadora.
- Coloque 3 corações dissecados em um círculo de caneta de barreira hidrofóbica e incube por 20 min em temperatura ambiente.
- Transvase a solução ao microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente durante pelo menos 5 min, de modo a que os corações se fixem completamente às lâminas de vidro.
- Lave as lâminas três vezes em PBS com 0,1% Tween 20 (PBST) por 5 min por lavagem.
- Adicione 50 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 1000 μL de PBST para obter uma solução de BSA a 5% e incube as lâminas em uma câmara úmida por 1 h para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.
- Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBST durante 5 min por lavagem.
- Diluir 2 μL de anticorpo monoclonal de camundongo contra 8-OHdG e 2 μL de anticorpo policlonal de coelho contra γH2AX em 296 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos primários funcional.
- Incube as amostras cardíacas com 50 μL da solução de coquetel de anticorpos primários contra 8-OHdG e γH2AX em uma câmara umidificada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C (a incubação noturna pode aumentar a intensidade do sinal).
- Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBST durante 5 min por lavagem.
- Diluir 1 μL de anticorpo secundário de cabra anti-camundongo marcado com FITC e 1 μL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra cy3 em 498 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos secundários de trabalho e incubar as amostras com os anticorpos secundários (1:500 em PBST) por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
- Transvase a solução e lave as amostras três vezes com PBS durante 5 min por lavagem protegida da luz.
- Adicione 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo) às amostras para coloração nuclear por 30 min à temperatura ambiente.
- Aplique uma lamínula para deslizar e selar com esmalte para evitar ressecamento e movimento. Em seguida, faça a imagem das amostras em um microscópio de fluorescência e quantifique o sinal de fluorescência da área do coração usando o software ImageJ. Calcule as mudanças relativas com a média das amostras de controle DMSO. Determine a significância estatística dos dados como na etapa 3.2.
