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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo
NOTA: A preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo usa ratos P6-7 Sprague-Dawley.
- Configuração da cultura e preparação do meio
- Na véspera da cultura, preparar os meios necessários e colocá-los a 4 °C.
- Prepare o meio de dissecação: 25 mM de glicose em solução salina balanceada Gey's (GBSS).
- Prepare o meio de cultura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Horse Serum (HS), 25 mM de glicose, 30 μg / mL de gentamicina.
- Prepare o meio de manutenção: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM de L-glutamina, 30 μg/mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
- Colheita de cérebros
- Imediatamente antes de iniciar a cultura, adicione 1,1 mL de meio de cultura a cada poço da placa de 6 poços com uma pipeta P1000 e coloque-o a 37 °C.
- Coloque todo o equipamento (microscópio de dissecação, picador de tecidos, lâmpada de dissecação, ferramentas de dissecação, eletrodos, placas, inserções e papéis de filtro) dentro do armário de segurança biológica e esterilize sob luz ultravioleta por 15 minutos.
- Ajuste a espessura da fatia para 350 μm.
- Retire o GBSS da geladeira. Adicione 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Serão necessárias seis placas de Petri por animal.
- Eutanasiar o filhote de rato. Execute a decapitação usando uma tesoura afiada na base do tronco cerebral do animal.
- Lave a cabeça do animal três vezes em GBSS frio e leve-a para dentro do armário de segurança.
- Isolamento de tecidos e preparação de fatias
- Insira firmemente uma pinça afiada nas órbitas oculares para segurar a cabeça.
- Usando uma tesoura fina, corte a pele/couro cabeludo ao longo da linha média, começando do forame vertebral em direção aos lobos frontais e coloque-o de lado.
- Corte da mesma forma o crânio e ao longo da fissura transversal cerebral (espaço entre o cérebro e o cerebelo). Com pinça longa curva, afaste-a.
- Descarte os bulbos olfatórios com uma espátula. Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal voltada para cima (Figura 1A).
- Insira a pinça fina no cerebelo e siga ao longo da linha média com a espátula abrindo cada hemisfério com muito cuidado (Figura 1B).
- Com pinças de curva curta, remova cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampo, sem tocar na estrutura do hipocampo. Em seguida, com uma espátula, corte abaixo de cada hipocampo (Figura 1C).
- Pegue um hemisfério e coloque-o, com o hipocampo voltado para cima, em um papel de filtro. Repita o procedimento com o outro hemisfério e coloque-o paralelo ao primeiro, no papel de filtro. Colocar o papel de filtro no picador de lenços de papel, com os hemisférios perpendiculares à lâmina, e cortar os hemisférios em fatias de 350 μm (figura 1D).
- Coloque o tecido fatiado em uma placa de Petri com GBSS frio (Figura 1E).
- Separe cuidadosamente as fatias usando os eletrodos de ponta redonda (Figura 1F). Mantenha apenas as fatias com córtex rinal e hipocampo estruturalmente intactos. As áreas DG e AC devem estar perfeitamente definidas, assim como o córtex entorrinal e peririnal (Figura 1G).
- Coloque cada fatia no inserto (Figura 1H-I), com uma espátula e um eletrodo de ponta redonda. Remova o excesso de meio de dissecção ao redor de cada fatia com uma pipeta P20 (Figura 1J). Quatro fatias do córtex rinal do hipocampo podem ser cultivadas em uma única inserção (Figura 1K).
- Manutenção da cultura
- Mude o meio a cada dois dias.
- Aquecer o meio a 37 °C.
- Retire as placas da incubadora. Pegue cada inserto segurando a borda plástica com uma pinça (Figura 1L).
- Use a mão livre para aspirar o meio do poço. Coloque o inserto de volta no poço e adicione 1 mL, com uma pipeta P1000, de meio fresco aquecido (Figura 1M). Repita para todas as inserções. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presas entre a membrana e o meio.
nota: Fatias epilépticas sofrem uma privação gradual e controlada de soro no meio. A partir de 9 dias In Vitro (DIV), as fatias são mantidas em NBA sem SH.
2. Registros eletrofisiológicos
NOTA: Os registros eletrofisiológicos foram realizados em cortes organotípicos córtex rinal-hipocampo em 7, 14 e 21 DIV em uma câmara do tipo interface. As gravações foram obtidas com amplificador, digitalizadas e analisadas com software. Todas as gravações foram filtradas por banda-pass (filtro de Bessel de oito polos a 60 Hz e filtro gaussiano a 600 Hz).
- Preparação da configuração
- Prepare 50 mL de meio NBA com 1 mL de B27 e 250 μL de L-Glutamina. Aquecer a 37 °C.
- Defina a configuração de eletrofisiologia em um circuito fechado. Verifique se a taxa de fluxo é de 2 mL / min.
- Abra a válvula da caixa da carbox (5% CO2/95% O2) e verifique o nível de água no sistema.
- Coloque o papel de filtro na câmara de gravação da interface para drenar o excesso de meio e o papel de limpeza da lente sob a armação para fornecer meio à fatia.
- Ligue o controlador de temperatura, os amplificadores e o micromanipulador.
- Deixe a temperatura na câmara de interface estabilizar a 37 °C antes de iniciar as gravações.
- Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glicose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 com pH 7,4) e use-o para encher o eletrodo de vidro com uma seringa. Coloque-o no eletrodo receptor.
- Registros de atividade espontânea
- Quando a temperatura estiver estável, remova a placa da incubadora e corte uma fatia da inserção com uma lâmina altamente afiada. Coloque-o em uma placa de 60 mm com uma gota de meio. Leve-o para a câmara de gravação da interface.
- Coloque a fatia na câmara de interface com o hipocampo no canto inferior direito. Coloque o eletrodo receptor na camada de células piramidais CA3.
- Prossiga para o protocolo de aquisição contínua e grave por 30 min.
