Ensaio de morte neuronal para avaliar a morte celular em modelo de epilepsia ex vivo

Resumo

Fonte: Carvalho, M., et al., Um modelo de epileptogênese em culturas de fatias organotípicas do córtex renal-hipocampo. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a técnica de avaliação da morte neuronal em fatias organotípicas do córtex rinal-hipocampo. A morte neuronal ocorre por meio de crises epilépticas em evolução - semelhantes à epilepsia in vivo - e é detectada por meio de coloração dupla das células mortas usando iodeto de propídio e imunofluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo

NOTA: A preparação de fatias de córtex rinal-hipocampo usa ratos P6-7 Sprague-Dawley.

1. Configuração da cultura e preparação do meio
   1. Na véspera da cultura, preparar os meios necessários e colocá-los a 4 °C.
   2. Prepare o meio de dissecação: 25 mM de glicose em solução salina balanceada Gey's (GBSS).
   3. Prepare o meio de cultura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Horse Serum (HS), 25 mM de glicose, 30 μg / mL de gentamicina.
   4. Prepare o meio de manutenção: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg / mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
2. Colheita de cérebros
   1. Imediatamente antes de iniciar a cultura, adicione 1,1 mL de meio de cultura a cada poço da placa de 6 poços com uma pipeta P1000 e coloque-o a 37 °C.
   2. Coloque todo o equipamento (microscópio de dissecação, picador de tecidos, lâmpada de dissecação, ferramentas de dissecação, eletrodos, placas, inserções e papéis de filtro) dentro do armário de segurança biológica e esterilize sob luz ultravioleta por 15 minutos.
   3. Ajuste a espessura da fatia para 350 μm.
   4. Retire o GBSS da geladeira. Adicione 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Serão necessárias seis placas de Petri por animal.
   5. Eutanasiar o filhote de rato. Realize a decapitação usando uma tesoura afiada na base do tronco cerebral do animal.
   6. Lave a cabeça do animal três vezes em GBSS frio e leve-a para dentro do armário de segurança.
3. Isolamento de tecidos e preparação de fatias
   1. Insira firmemente uma pinça afiada nas órbitas oculares para segurar a cabeça.
   2. Usando uma tesoura fina, corte a pele/couro cabeludo ao longo da linha média, começando do forame vertebral em direção aos lobos frontais e coloque-o de lado.
   3. Corte da mesma forma o crânio e ao longo da fissura transversal cerebral (espaço entre o cérebro e o cerebelo). Com pinça longa curva, afaste-a.
   4. Descarte os bulbos olfatórios com uma espátula. Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal voltada para cima (Figura 1A).
   5. Insira a pinça fina no cerebelo e siga ao longo da linha média com a espátula abrindo cada hemisfério com muito cuidado (Figura 1B).
   6. Com pinças de curva curta, remova cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampo, sem tocar na estrutura do hipocampo. Em seguida, com uma espátula, corte abaixo de cada hipocampo (Figura 1C).
   7. Pegue um hemisfério e coloque-o, com o hipocampo voltado para cima, em um papel de filtro. Repita o procedimento com o outro hemisfério e coloque-o paralelo ao primeiro, no papel de filtro. Colocar o papel de filtro no picador de tecidos, com os hemisférios perpendiculares à lâmina, e cortar os hemisférios em fatias de 350 μm (figura 1D).
   8. Coloque o tecido fatiado em uma placa de Petri com GBSS frio (Figura 1E).
   9. Separe cuidadosamente as fatias usando os eletrodos de ponta redonda (Figura 1F). Mantenha apenas as fatias com córtex rinal e hipocampo estruturalmente intactos. As áreas DG e AC devem estar perfeitamente definidas, assim como o córtex entorrinal e peririnal (Figura 1G).
   10. Coloque cada fatia no inserto (Figura 1H-I), com uma espátula e um eletrodo de ponta redonda. Remova o excesso de meio de dissecção ao redor de cada fatia com uma pipeta P20 (Figura 1J). Quatro fatias do córtex rinal do hipocampo podem ser cultivadas em um único inserto (Figura 1K).
4. Manutenção da cultura
   1. Mude o meio a cada dois dias.
   2. Aquecer o meio a 37 °C.
   3. Retire as placas da incubadora. Pegue cada inserção segurando a borda plástica com uma pinça (Figura 1L).
   4. Use a mão livre para aspirar o meio do poço. Coloque o inserto de volta no poço e adicione 1 mL, com uma pipeta P1000, de meio fresco aquecido (Figura 1M). Repita para todas as inserções. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presas entre a membrana e o meio.
      nota: Fatias epilépticas sofrem uma privação gradual e controlada de soro no meio. A partir de 9 dias In Vitro (DIV), as fatias são mantidas em NBA sem SH.

2. Ensaio de fixação de PI

NOTA: A morte celular foi avaliada monitorando a captação celular do corante fluorescente iodeto de propídio (PI). PI é um composto polar, que entra em células com membranas celulares danificadas e interage com o DNA emitindo fluorescência vermelha (absorbância 493 nm, emissão 630 nm). Como o IP não é permeado a células vivas, ele é usado para detectar células mortas em uma população.

1. Incubação PI
   1. Preparar, em meio de cultura, uma nova diluição de 1:10 do estoque PI.
   2. Para o ensaio de captação de PI, remova a placa da incubadora e levante cuidadosamente a inserção. Adicionar 13 μL de PI ao meio, com uma pipeta P20, obtendo uma concentração final de 2 μM. Agitar lentamente a placa antes de voltar a colocar a pastilha. Certifique-se de que não haja bolhas sob as fatias.
   3. Colocar as fatias de volta na incubadora a 37 °C por 2 h.
   4. Prossiga com o protocolo de imuno-histoquímica, conforme descrito na próxima seção. Cubra as placas com alumínio, pois o PI é sensível à luz.

3. Imuno-histoquímica

NOTA: Na imuno-histoquímica, um anticorpo neurônio-específico, bem como anticorpos capazes de discriminar fenótipos em repouso e reativos de micróglia e astrócitos, foram usados para avaliar a extensão da morte neuronal e gliose em fatias organotípicas semelhantes a epilépticos do córtex rinal-hipocampo.

1. Fixação tecidual
   1. Retire a placa da incubadora e aspire o meio. Fixe as fatias com paraformaldeído (PFA) a 4% por 1 h em RT, adicionando 1 mL de PFA abaixo e acima das fatias, com uma pipeta P1000.
   2. Remova o PFA e adicione 1 mL de PBS. Além disso, adicione PBS abaixo e acima das fatias.
   3. Manter as fatias a 4 °C, em PBS, até nova utilização. Sempre coloque um parafilme ao redor das placas para evitar que sequem.
2. Etapas de imunomarcação
   1. Lave duas vezes, 10 min de cada vez, com 1 mL de PBS.
   2. Prepare a solução de permeabilização/bloqueio contendo 1% de Triton-X100, 10% de HS e 10% de BSA em PBS. Prepare a solução de BSA a 5%.
   3. Desenhe dois retângulos com a caneta hidrofóbica (Figura 2A). Corte as fatias do inserto (Figura 2B) com uma lâmina bem afiada. Coloque duas fatias por lâmina (Figura 2C) e adicione 140 μL de solução de permeabilização/bloqueio no topo de cada fatia, usando uma pipeta P200. Incubar durante 3 h à temperatura de saída.
   4. Diluir os anticorpos primários para a diluição de trabalho em 5% de BSA em PBS. Incubar com os anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
   5. Incubar com os anticorpos secundários durante 4 h em RT. A partir desta etapa, proteja a placa da luz, pois os fluoróforos estão sendo trabalhados.
   6. Colocar uma gota de 50 μl de solução de Hoechst no topo de cada fatia e incubar durante 20 min em RT.
   7. Lave entre as incubações. Sempre lave três vezes, por 10 minutos de cada vez, com PBS-T.
   8. Remova o Hoechst e lave conforme recomendado.
   9. Adicione 50 μL de meio de montagem na parte superior de cada fatia. Cubra com uma lamínula de vidro e envolva com esmalte (Figura 2D).
   10. Deixe secar em RT por 24 h.
   11. Visualize a imunocoloração sob um microscópio confocal. Mantenha as fatias manchadas a -20 °C.

Resultados

Figura 1: Procedimento detalhado para a preparação de fatias organotípicas de córtex rinal-hipocampo. (A) Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal voltada para cima. (B) Insira a pinça no cerebelo. Abra o cérebro através da linha média e remova o excesso de tecido sobre o hipocampo. (C) Com uma espátula cortada abaixo do hipocampo, conforme indic...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de centrífuga de 50 mL, fundo cônico	Corning	430829
70% de etanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Anti-NeuN (coelho)	Werfen	16712943S	Diluir na proporção de 1:500
Suplemento B-27™ (50X), sem soro	Thermo Fisher Científico	Rolamento 17504-044
Lâminas para cabo de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10011-00
Albumina de soro bovino (BSA)	NZYTech	MB04602	5% de BSA é usado para diluir os anticorpos primários. Adicione 0,5 g de BSA em 10 mL de PBS.
Sistema de câmara de fatia de cérebro/tecido	Warner Instruments
Insertos de cultura de células, 30 mm, PTFE hidrofílico	Millipore SAS	PICM03050
Fonte de luz fria	Schott	KL 300 LED
Microscópio confocal a laser	Zeiss	LSM 710
Incubadora convencional	Thermo Scientific Heraeus	BB15, linha de função	Defina para 37 °C e 5% de CO2
D(+)-Glicose monohidratada	Merck Millipore	Rolamento 1.08342.1000
Solução de D-(+)-glicose, 45% em água	sigma	G8769
hidrogenofosfato di-sódico di-hidratado	Merck Milipore	Rolamento 1.06580.1000
Microscópio/lupa de dissecação	MEIJI TECHNO CO., LTD	122285
IgG anti-coelho de burro (H+L) acoplado a Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	Diluir na proporção de 1:500
Dumont #5 Pinça Fina Biologie Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11254-20
Fórceps Dumont #5 Standard Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11251-20
Dumont #7 Fórceps Padrão Dumoxel	Ferramentas de Belas Ciências	11271-30
Fórceps de #7S Médica Dumont Curva Curta Inox	Ferramentas de Belas Ciências	11273-22
Solução-mãe de gentamicina, 50 mg/ml	Thermo Fisher Científico	15750-037
Solução salina balanceada de Gey (GBSS)	Indústrias Biológicas	01-919-1A
Eletrodos de vidro	Produtos Científicos	GB150F-10	Dicas redondas caseiras
Pipetas Pasteur de vidro, 230 mm	VWR Internacional	Nº 612-1702
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 24020-091
Soro de cavalo, inativado por calor (HS)
ácido clorídrico	Thermo Fisher Científico	Rolamento 26050-088
Caneta hidrofóbica	Merck Milipore	Rolamento 1.09057.1000
INCU-Linha IL10	Dako	S200230-2
Espátula de íris curva	Warner Instruments	Topo BSC-HT Haas
Gabinete de Segurança Biológica Classe II para Labcultura	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 10092-12
Papel de limpeza de lentes	HERASafe	HS 12
Solução de L-Glutamina 200 mM (Q)	ENDURECER
Microtubo 0,5 mL, PP	Merck Millipore	Rolamento 1.05886.0500
Micro tubo 1,5 mL, PP	SARSTEDT	72.699
Microtubo 2,0 mL, PP	SARSTEDT	Nº 72.690.001
Óculos de cobertura para miroscópio, 24 mm x 60 mm	Instrumento Sutter	MP-285
esmalte	Marienfeld	102242
Meio Neurobasal-A (NBA)	Clichê
Opti-MEM® I Meio de Soro Reduzido	Thermo Fisher Científico	Rolamento 10888-022
Paraformaldeído em pó	Thermo Fisher Científico	Rolamento 31985-047
Bomba peristáltica	Produtos químicos da VWR	2,87,94,295
Tampão salino fosfato (PBS)	Gilson	M312
Soluções-padrão de fosfato, PO43- em água			caseiro. PBS com 0,5% Tween-20 (PBS-T) é usado para lavar fatias durante o ensaio imuno-histoquímico.
Conjunto de pipetas	AGORA ARISTAR	Rolamento 452232C
Platina 5 lâminas	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Iodeto de propídio (PI)	Sigma-Aldrich	Pág. 5405-250g
Papel de Filtro Qualitativo, Celulose, Grau 1, 55 mm	Sigma-Aldrich	Pág. 4170-25MG	Solução de reserva a 1 mg/ml em água.
Papel de Filtro Qualitativo, Celulose, Grau 1, 90 mm	O que homem	1001-055	Retenção média 11μm
Cabo de bisturi	O que homem	Rolamento 1001-090	Retenção média 11μm
Seringa de Insulina com Ponta Deslizante sem Agulha 1 mL	Ferramentas de Belas Ciências	91003-12
Tesoura de Estudante Reta SharpSharp 12cm	Grupo de produtos GRASS da Astro Med Inc	Estimulador S48
Lâminas SuperFrost Plus™ Adhesion	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91402-12
Placa de cultura de tecidos estéril tratada com TC de 60 x 15 mm	Thermo Fisher Científico	J1800AMNZ
Placas estéreis de 6 poços tratadas com TC	Corning	CORN430166
Picador de tecidos	SISTEMAS MÉDICOS CORP.	TC-102
Tritão X-100	O Laboratório Mickle Engineering CO. LTD.	MTC/2	Defina para 350 μm
Interpolação-20	BDH	Rolamento 14630
	sigma	Pág. 2287