Ensaio de agregação PolyQ para identificar o efeito neuroprotetor de um composto em vermes

Resumo

Fonte: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para a descoberta de compostos bioativos contra a neurotoxicidade mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo descreve um método in vivo para rastrear o potencial protetor de compostos de teste neuroprotetores na redução da agregação poliQ em células musculares da parede corporal de nematóides e na melhoria da proteotoxicidade associada à agregação.

Protocolo

1. Ensaio de agregação PolyQ

1. Preparação de nematóides para o ensaio de agregação polyQ
   1. Transfira 300-500 larvas L1 sincronizadas de AM141 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 μL de meio S contendo OP50 (OD₅₇₀ de 0,7-0,8) e 5 mg / mL de astrágalo, normalmente um poço por tratamento por um ponto de tempo.
   2. Selar a placa com parafilme e incubar a 20 °C e 120 rpm durante 24, 48, 72 e 96 h.
   3. Colha os nematóides em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e lave com tampão M9 >3 vezes por centrifugação (1000 × g por 1 min) para remover o OP50 restante. Ressuspenda os nematóides AM141 no tampão M9 e mantenha-os prontos para aquisição de imagens.
2. Aquisição de imagens fluorescentes e análise de dados
   NOTA: Os dados são analisados automaticamente com este sistema de imagem de alto conteúdo. Se um dispositivo de imagem automatizado não estiver disponível, um método convencional para preparar uma almofada de agarose para aquisição de imagem pode ser usado para obter desempenho semelhante usando um microscópio fluorescente comum.
   1. Transfira 10-15 nematóides para cada poço em uma placa de 384 poços (volume final de 80 μL por poço). Defina 10 poços replicados para cada tratamento.
   2. Adicione 10 μL de azida sódica 200 mM a cada poço para paralisar os nematóides e permitir que eles se depositem no fundo (5-10 min).
   3. Coloque a placa em um sistema de imagem de alto conteúdo para adquirir imagens fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre dispositivos e software).
   4. Abra o software de aquisição de imagem e configure os seguintes parâmetros.
      1. Abra a janela Configuração de aquisição de placa e crie um novo conjunto de experimentos e nome.
      2. Selecione Ampliação como 2x, Compartimento da câmera como 1 e Tipo de placa como placa de 384 poços.
      3. Defina os poços e locais (local único) a serem visitados.
      4. Selecione o filtro isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ative as opções de foco baseadas em imagem.
      5. Defina a Exposição como 300 ms.
         nota: As configurações acima podem ser testadas e ajustadas para otimizar os parâmetros de imagem.
      6. Salve as configurações de aquisição de imagem e clique no botão Adquirir placa para executar.
   5. Analise os dados da imagem usando o software de análise de imagem.
      1. Abra a janela Revisar dados da placa e selecione a placa de teste para análise de imagem.
      2. Clique duas vezes em um poço de teste para exibir sua imagem.
      3. Selecione Contar Núcleos como método de análise e clique no botão Definir Configurações para abrir uma janela para as seguintes configurações.
      4. Defina a imagem de origem do canal FITC e selecione o Algoritmo padrão.
      5. Defina os parâmetros de análise de imagem da seguinte forma: largura mínima aproximada = 10 μm (= 2 pixels); largura máxima aproximada = 50 μm (= 12 pixels); intensidade acima do fundo local = 1.000-2.000 níveis de cinza.
      6. Teste as configurações atuais para otimizar o método de análise.
      7. Salve as configurações e execute a análise em todos os poços.
         nota: Demora ~ 20 min para concluir a análise de uma placa de 384 poços.
      8. Exporte o Total de Núcleos como o número total de agregados Q40::YFP em cada poço.
   6. Conte o número de nematóides em cada poço.
   7. Calcule o número médio de agregados Q40::YFP por nematóide em cada grupo e aplique um ajuste de curva não linear aos dados de cada ponto no tempo.
   8. Calcule o índice de inibição:
      Índice de inibição = (N_controle - N_amostra) / Ncontrol
      Onde N_controle e N_amostra são o número médio de agregados Q40::YFP nos grupos controle e tratamento, respectivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cepa de C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
Cepa de E. coli
OP50	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
Azida de sódio	Fornecedor verificado - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
equipamento
Placa de cultura de células de 384 poços	Nest Biotecnologia Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=pt&product_id=85
Placa de cultura celular de 48 poços	Nest Biotecnologia Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=pt&product_id=85
Microscópio de fluorescência	Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Sistema de imagem de alto conteúdo	Dispositivos Moleculares	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ produtos/cellular-imagingsystems#High-Content-Imaging
Microcentrífuga	Empresa Genética	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Casa/Bens/goodsdetails/gid/189.html
Parafilme M	Sigma-Aldrich	Pág. P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Câmera digital para microscópio	Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
software
Software de aquisição e análise de imagens	Dispositivos Moleculares	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ produtos/sistemas de imagem celular/ software de aquisição e análise/ metaxpress