Um ensaio para estudar o efeito do composto de teste contra a neurotoxicidade mediada por PolyQ em vermes

Resumo

Fonte: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra a neurotoxicidade mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos um método para avaliar o efeito neuroprotetor de um composto de teste, o astragalano, na sobrevivência neuronal em Caenorhabditis elegans da neurotoxicidade mediada por poliQ. O ensaio usa Caenorhabditis elegans expressando as repetições poliQ anormalmente expandidas fundidas à GFP em seus neurônios ASH para medir a sobrevivência neuronal após o tratamento com o composto de teste.

Protocolo

1. Ensaio de neurotoxicidade mediado por PolyQ

1. Tratamento de C. elegans com amostras de teste
   1. Para preparar nematóides para o ensaio de neurotoxicidade polyQ, transfira 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 μL de meio S contendo OP50 (OD₅₇₀ de 0,7-0,8) e 5 mg / mL de astrágalo; normalmente três poços replicados para cada tratamento.
   2. Selar a placa com parafilme e incubar a 15 °C e 120 rpm durante 3 dias.
   3. Colete os nematóides por centrifugação e lave 3-5 vezes com tampão M9. Ressuspenda os nematóides no tampão M9 para uso em ensaios de sobrevivência e prevenção neuronal.
2. Preparação de almofada de agarose
   1. Adicione 2 g de agarose a 100 mL de tampão M9 (2%, p / v) e aqueça a solução de agarose no micro-ondas até quase ferver.
   2. Dispense 0,5 mL de agarose derretida no centro de uma lâmina de vidro de microscopia de 1 mm de espessura colocada entre dois pedaços de placas de vidro de 2 mm de espessura. Cubra com outra lâmina verticalmente. Assim que a agarose esfriar e solidificar, remova suavemente a corrediça superior.
3. Ensaio de sobrevivência neuronal ASH
   1. Adicione uma gota de 20 mM de azida sódica na almofada de agarose. Transfira 15-20 nematóides HA759 para a gota para imobilizá-los.
   2. Coloque uma lamínula suavemente sobre os nematóides. Mantenha a lâmina sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera digital. Selecione uma lente objetiva de 40x e um filtro FITC para detectar neurônios ASH positivos para GFP na região da cabeça dos nematóides.
   3. Selecione mais de 50 nematóides em cada grupo aleatoriamente para contar o número de nematóides com neurônios ASH bilaterais marcados com GFP em sua região da cabeça. Calcule a taxa de sobrevivência dos neurônios ASH:
      Sobrevida neuronal (%) =
      Onde N_{sobrevivência} e N_total são o número de nematóides com neurônios ASH positivos para GFP e o número total de nematóides testados em cada grupo, respectivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cepa de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Cepa de E. coli
OP50	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
agarose	Biooeste	Rolamento 111860
Azida de sódio	Fornecedor verificado - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
equipamento
Placa de cultura celular de 48 poços	Nest Biotecnologia Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Microscópio de fluorescência	Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
Sistema de imagem de alto conteúdo	Dispositivos Moleculares	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Microcentrífuga	Empresa Genética	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Câmera digital para microscópio	Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
microondas	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilme M	Sigma-Aldrich	Pág. P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
software
Software de aquisição e análise de imagens	Dispositivos Moleculares	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ produtos/sistemas de imagem celular/ software de aquisição e análise/ metaxpress