Examine o comportamento de prevenção de quimioterapia em vermes transgênicos usando o ensaio de prevenção osmótica

Abstract

Fonte: Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra a neurotoxicidade mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve um ensaio de evitação osmótica para examinar o comportamento de quimioevitação em um modelo de verme transgênico. O comportamento de evitação é testado em uma placa na presença de uma barreira osmótica alta e quimioatraente. Os vermes com perda funcional de neurônios são atraídos pelo quimioatraente, atravessam a barreira osmótica alta e ficam paralisados na zona de armadilha por causa da solução anestésica.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter as receitas das soluções usadas neste protocolo.

1. Preparação de materiais para o ensaio de Caenorhabditis elegans

1. Manutenção de cepas de C. elegans
   1. Obtenha cepas de C. elegans (AM141 e HA759) e Escherichia coli (OP50 e NA22) (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Manter os nemátodes na placa de meios de crescimento de nemátodes (NGM) semeada com E. coli OP50 a 20 °C para AM141 ou 15 °C para HA759.
2. Preparação de cultura bacteriana de E. coli OP50
   1. Escolha uma única colônia de E. coli OP50 de uma placa de raia Luria-Bertani (LB) e inocule-a em 50 mL de cultura LB líquida.
   2. Incubar as bactérias OP50 num agitador a 37 °C e 200 rpm até obter uma densidade óptica de ~0,5 a 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Conservar a cultura bacteriana OP50 a 4 °C e utilizá-la no prazo de duas semanas.
3. Preparação de placas NGM com bactérias OP50
   1. Adicione 20 g de ágar, 2,5 g de peptona, 3,0 g de NaCl e 975 mL de água deionizada a um frasco autoclavável de 1 L. Autoclave a 121 °C por 30 min.
   2. Coloque o frasco de ágar NGM líquido na bancada para esfriar a ~ 60 ° C e, em seguida, adicione as seguintes soluções de estoque estéreis: 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 5 mg / mL de colesterol e 25 mL de fosfato de potássio 1 M (pH 6.0).
   3. Despeje 20 mL de NGM em uma placa de Petri estéril de 90 mm e deixe as placas na bancada esfriarem e solidificarem. Mantenha as placas de cabeça para baixo e deixe-as secar na bancada em temperatura ambiente por 2 dias.
   4. Dispense 200 μL da cultura bacteriana OP50 em cada placa NGM e espalhe uniformemente com uma haste de revestimento de vidro estéril. Feche as tampas e incube as placas durante a noite a 37 °C.
   5. Armazene as placas NGM semeadas com OP50 em uma caixa plástica com tampa em temperatura ambiente e use dentro de duas semanas.
4. Preparação da população de C. elegans sincronizada por idade
   1. Colete nematóides adultos grávidas em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e centrifugue a 1000 × g por 1 min. Lave três vezes e ressuspenda os nematóides em tampão M9.
   2. Adicione um volume igual de solução de alvejante e agite suavemente por 3-5 min. Monitore o clareamento a cada 15 s sob um microscópio de dissecação.
      nota: A solução de alvejante deve ser preparada recentemente antes do uso, misturando volumes iguais de NaOCl a 10% e NaOH 1 M (Tabela 1).
   3. Uma vez que a maioria dos nematóides esteja quebrada, pare a digestão diluindo com tampão M9. Centrifugue rapidamente para remover o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão M9 para repetir a lavagem três vezes.
   4. Ressuspenda o pellet em meio S. Deixe os resíduos do nematóide se estabelecerem por gravidade por 2-3 min enquanto os ovos permanecem no sobrenadante.
   5. Aspirar o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga estéril. Recolha os ovos por centrifugação a 1000 × g durante 1 min.
   6. Descarte ~ 80% do sobrenadante e transfira os ovos para um frasco estéril contendo 20 mL de meio S. Colocar o balão num shaker e incubar os ovos durante a noite sem alimentos a 120 rpm para obter nemátodos L1 sincronizados.

2. Ensaios de neurotoxicidade mediados por PolyQ

1. Tratamento de C. elegans com amostras de teste
   1. Para preparar nematóides para o ensaio de neurotoxicidade polyQ, transfira 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 μL de meio S contendo OP50 (OD570 de 0,7-0,8) e 5 mg / mL de astragalano, normalmente três poços replicados para cada tratamento.
   2. Selar a placa com parafilme e incubar a 15 °C e 120 rpm durante 3 dias.
   3. Colete os nematóides por centrifugação e lave 3-5 vezes com tampão M9. Ressuspenda os nematóides no tampão M9 para uso em ensaios de sobrevivência e prevenção neuronal.
2. Ensaio de evitação osmótica
   1. Divida uma placa NGM sem alimentos (9 cm) em zonas normais (N) e armadilhas (T) por uma linha de glicerol (~ 30 μL) de 8 M no meio. Espalhe uma linha de azida sódica de 200 mM (~ 20 μL) a ~ 1 cm de distância da linha de glicerol para paralisar os nematóides que atravessam a barreira de glicerol para a Zona T.
   2. Transfira ~ 200 nematóides cada para a Zona N de três placas replicadas para cada grupo. Adicione uma gota de 1% de butanodiona (~ 2 μL) na Zona T (1 cm da borda da placa) para atrair os nematóides. Cubra imediatamente a tampa da placa de Petri e incube a 23 °C durante 90 min.
   3. Marque o número de nematóides nas zonas N e T ao microscópio. Calcule o índice de evitação usando eq.
      Índice de evitação = N / (T + N)
      Onde N e T são o número de nematóides nas zonas N e T, respectivamente. Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão (DP) de três repetições, representativas de >3 experimentos independentes.
   4. Realize um teste t bicaudal não emparelhado para comparar os dados dos grupos astragalano e controle.

Tabela 1:

solução	Instruções de preparação	armazenamento
1 M CaCl2	111 g de CaCl2	Armazenar em temperatura ambiente (RT)
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave
1 M Fosfato de potássio (pH 6,0)	108,3 g de Receptor de Gordura2PO4	Armazenar no RT
	35,6 K2HPO4
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave
1 M MgSO4	246 g de MgSO4·7H2O	Armazenar no RT
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave
Colesterol em etanol (5 mg/mL)	0,5 g de colesterol	Armazene a -20 °C
	Adicionar etanol a 100 mL
	Não autoclave!
1 M Citrato de potássio (pH 6,0)	Adicione 10,0 g de ácido cítrico monohidratado	Armazenar no RT
	Adicione 146,75 g de ácido cítrico tripotássico monohidratado
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave
Solução de traços de metais	0,93 g de EDTA dissódico	Armazenar no escuro no RT
	0,345 g de FeSO4·7H2O
	0,1 g de MnCl2·4H2O
	0,145 g de ZnSO4·7H2O
	Adicionar 0,0125 g de CuSO4·5H2O
	Adicionar dH2O a 500 mL
	autoclave
1 M NaOH	4 g de NaOH	Armazenar no RT
	Adicionar dH2O a 100 mL
Solução de alvejante	0,5 mL de NaOH 1 M	Prepare fresco antes de usar
	0,5 mL de NaOCl a 10%
M9 buffer	5 g de NaCl	Armazenar no RT
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave
	Adicione 1 mL de 1 M MgSO4
S basal	5,85 g de NaCl	Armazenar no RT
	6,0 g de KH,2PO4
	1,0 g K2HPO4
	Adicionar dH2O a 973 mL
	Autoclave e resfriamento a ~ 60 ° C
	Adicione 1 mL de colesterol 5 mg / mL em etanol
S médio	S basal	Armazenar no RT
	Adicione 3 mL de 1 M CaCl2
	Adicione 3 mL de 1 M MgSO4
	Adicione 10 mL de citrato de potássio 1 M
	Adicione 10 mL de solução de metais traços
	Todos os componentes foram autoclavados, não autoclave
5 mg/mL de astragalano	0,1 g de astragalano	Armazenar em alíquotas a -80 °C
	Adicione 20 mL de meio S
	Filtro através de filtro de seringa de 0,22 μm
200 mM de azida sódica	1,3 g de NaN3	Conservar a 4 °C
	Adicione 100 mL de meio S
8 M Glicerol	73,67 g de glicerol	Armazenar no RT
	Adicionar dH2O a 100 mL
Estoque de butanodiona a 10%	Misture 10 μL de butanodiona com 90 μL de dH2O	Loja na RT
1% de butanodiona	Adicione 10 μL de estoque de butanodiona a 90 μL de dH2O	Loja na RT
1 L da cultura Luria-Bertani (LB)	10 g de NaCl	Armazenar no RT
	10 g de triptona
	5 g de extrato de levedura
	Adicionar dH2O a 1 L
	autoclave

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cepas de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Cepas de E. coli
NA22	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
Ágar	Xangai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Butanodiona	Fornecedor verificado - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
colesterol	Sigma-Aldrich	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
Glicerol	Fornecedor:Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Peptona	Fornecedor verificado - Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.	050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Azida de sódio	Fornecedor verificado - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
hidróxido de sódio	Fornecedor verificado - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6
Solução de hipoclorito de sódio	Fábrica de reagentes químicos de Guangzhou	Rolamento 7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Triptona	Oxóide Ltda.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Extrato de levedura	Oxóide Ltda.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
equipamento
Placa de cultura celular de 48 poços	Nest Biotecnologia Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Placa de Petri de 90 mm	Fornecedor verificado - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Microscópio de dissecação	Fornecedor verificado - ChongQing Optical Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Microcentrífuga	Empresa Genética	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilme M	Sigma-Aldrich	Pág. P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
shaker	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html