Ensaio de ferida para avaliar a capacidade migratória de mioblastos murinos em co-cultura

Resumo

Fonte: Toubat, O. et al., Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve um ensaio de cicatrização de feridas em co-cultura sem contato para avaliar a capacidade migratória de mioblastos murinos. Isso ajuda a entender os componentes de envio e recepção de sinal das interações parácrinas de sinalização Wnt não canônicas in vitro.

Protocolo

1. Ensaio de ferida:

(A Figura 1 descreve o modelo esquemático do ensaio)

1. Permita que as inserções de células O9-1 e os poços da câmara celular C2C12 adiram e proliferem na incubadora até que ambas as células estejam em ~ 70-80% de confluência antes de prosseguir com esta parte do protocolo. Se as células crescerem >90% confluentes, não prossiga com o ensaio de arranhão, pois as células simplesmente se desprenderão do poço.
2. Aqueça 1x PBS e C2C12 meio, colocando-os em banho-maria a 37 °C.
3. Remova bem o meio sobrenadante da câmara C2C12 e lave as células uma vez com 1x PBS. Remova o 1x PBS e arranhe imediatamente as células com uma ponta de pipeta P10 estéril.
   1. Passe a ponta da pipeta P10 estéril firmemente em uma única direção para abranger todo o comprimento ou largura da monocamada da célula (por exemplo, da direita para a esquerda, de cima para baixo). Certifique-se de arranhar cada poço contendo células apenas uma vez.
      nota: Para otimizar os resultados de arranhões, risque poços de diferentes condições experimentais em um nível semelhante de confluência. Para fazer isso, certifique-se de que cada poço de 4 câmaras tenha células para cada condição experimental necessária (por exemplo, poço # 1 controle negativo, poço # 2 controle positivo). Além disso, use uma nova pipeta P10 estéril para cada arranhão e aplique uma quantidade semelhante de força na pipeta a cada vez. Não tente criar mais de um arranhão em cada poço.
   2. Depois de coçar, adicione rapidamente 1 mL de 1x PBS de volta ao poço usando uma ponta de pipeta P1000. Repita esse processo para cada poço que será riscado.
      nota: Dada a variabilidade associada a cada arranhão, recomenda-se que vários poços (n = 3) sejam usados para a criação de feridas em cada condição experimental. Trabalhe rapidamente, pois é fundamental minimizar a duração em que as células ficam sem 1x PBS durante essas etapas. Depois de remover 1x PBS de cada poço, não se deve levar mais de 5 s para gerar uma ferida em cada poço.
4. Depois de gerar uma ferida e adicionar 1x PBS de volta em cada poço, imagine o arranhão usando um microscópio invertido de campo claro e use esta imagem como o tamanho da ferida de linha de base (tempo 0). Para tirar imagens, execute as seguintes etapas:
   1. Ligue o computador e o microscópio (consulte a Tabela de Materiais) pressionando o botão liga/desliga. Coloque a corrediça da câmara no palco e gire o mostrador da objetiva para uma ampliação de 5x.
   2. Abra o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) clicando duas vezes no ícone do software na área de trabalho do computador. Clique na guia Câmera na tela inicial do software. Clique no botão Ao vivo para visualizar as células na guia AxioCam IC.
   3. Certifique-se de que o filtro de luz seja puxado totalmente para fora para permitir que a luz passe para a câmera e a tela do computador. Mova e/ou gire manualmente a lâmina da câmara para posicionar a área da ferida no centro da imagem ao vivo na guia AxioCam IC.
   4. Para tirar imagens, clique em encaixar para abrir uma nova guia ao lado da guia AxioCam IC que contém a imagem.
   5. Para salvar esta imagem estática, clique em arquivo no canto superior esquerdo da página inicial do software | salvar como | digite o nome do arquivo na caixa nome do arquivo. Salve a figura no formato de imagem Carl Zeiss (*.czi) (a configuração padrão) e selecione área de trabalho na barra à esquerda para salvar o arquivo na área de trabalho como um arquivo .czi, que só pode ser aberto no programa de software Zen lite 2012.
   6. Para salvar a imagem como um .tiff, clique em arquivo | salvar como | digite o nome do arquivo na caixa de nome do arquivo. Salve a figura como arquivo de imagem marcado (*.tiff) clicando no botão salvar como tipo e selecionando *.tiff no menu suspenso.
      nota: O formato .tiff pode ser aberto em qualquer software de processamento de imagem.
   7. Reposicione manualmente a lâmina da câmara para tirar mais 2-3 imagens em outros pontos da ferida no mesmo poço.
      nota: No total, isso resultará em 3-4 imagens não sobrepostas e de alta ampliação da ferida em cada poço.
5. Remova o 1x PBS de cada poço e adicione 1 mL de meio C2C12.
   nota: Tenha cuidado para não pipetar muito agressivamente ao remover ou adicionar soluções ao poço da câmara após a geração da ferida, pois isso pode fazer com que as células se desprendam do poço da câmara. Além disso, incline bem a câmara para que a aspiração e a reintrodução de soluções possam ser feitas nos cantos de cada poço para minimizar a ruptura da monocamada celular.
6. Monte o sistema de cocultura de insertos de poços colocando manualmente os insertos contendo as células O9-1 em cada poço do poço da câmara. Empurre suavemente as inserções para baixo no poço, de modo que a parte inferior da inserção fique logo acima das células C2C12 subjacentes. Retorne as construções de inserção de poço para a incubadora.
   nota: Não permita que a parte inferior do inserto toque fisicamente e interrompa mecanicamente as células C2C12 subjacentes.
7. Permita que as células migrem por um total de 9 a 12 h. Para determinar o tempo ideal de migração, verifique as células 6 h após a criação da ferida e, a partir de então, a cada 2-3 h. Encerre o experimento quando as células em condições de controle ou controle positivo começarem a cobrir completamente a ferida.
   nota: Dada a natureza sem contato da construção, a pastilha sobrejacente não precisa ser removida dos poços ao verificar a progressão da migração do intervalo. A variabilidade migratória será observada dependendo de fatores como os tipos de células usados neste ensaio, densidade celular no momento da geração da ferida, largura da ferida criada e condições experimentais de células manipuladas (por exemplo, knockdown de genes, adição de proteína recombinante). As concentrações desses reagentes devem ser determinadas experimentalmente com base nas recomendações do fabricante.

Resultados

Figura 1: Modelo esquemático do ensaio.A etapa 1 inclui a expansão in vitro de mioblastos C2C12 e NCCs usando células alimentadoras de STO. A etapa 2 envolve o plaqueamento de células NCCs e C2C12 no sistema de cocultura. A etapa 3 inclui o ensaio de ferida realizado em células C2C12 subjacentes para avaliar a capacidade migratória celular. A etapa 4 envolve a imunomarcação da faloidina para...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular de mioblastos murinos C2C12	ATCC	CRL-1772
Sistema de Corrediça de Câmara, 4 poços	ThermoFisher Scientific	154526
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta (4,5 g/L), lglutamina (2 mM)	Corning	10-017-CV	Conservado a 4 °C
Ponteiras de pipeta graduadas e estéreis, 10 μL	EUA Científico	1111-3810
Linha celular de crista neural O9-1	Millipore Sigma	SCC049
Tampão fosfato salino (PBS), 1x, sem cálcio e magnésio, pH 7,4	Corning	21-040-CV	Conservado a 4 °C
Suporte permeável Falcon para placa de 24 poços com membrana PET transparente de 0,4 μM	Corning	353095
Soro fetal bovino	Fisher Científico	W3381E	Armazenado em alíquotas de 50 mL a -20 °C
Microscópio óptico Zeiss invertido Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Software de microscopia Zen lite 2012	Carl Zeiss AG		Software de imagem