Ensaio de imunoabsorção enzimática para verificar conjugados anticorpo-antígeno quimicamente acoplados

Resumo

Fonte: Volckmar, J. et al., Conjugação química de um anticorpo purificado direcionado a DEC-205 com proteína de comprimento total para atingir células dendríticas de camundongo in vitro e in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a detecção de complexos anticorpo-antígeno quimicamente conjugados por meio da técnica de ensaio imunoenzimático em sanduíche, ou ELISA. O anticorpo capturado se liga ao epítopo específico do antígeno do conjugado anticorpo-antígeno, que pode ser visualizado posteriormente usando um anticorpo secundário ligado a enzimas.

Protocolo

1. Produção de αDEC-205 a partir da linha celular de hibridoma NLDC-145

1. Para a produção de anticorpos, descongele as células NLDC-145 criopreservadas que produzem αDEC-205 a 37 °C em banho-maria. Expandir as células a 37 °C e 5% de CO₂. Serão necessários dois frascos de 75 cm² para prosseguir com a produção de anticorpos. Os procedimentos de cultura de células devem ser realizados em uma cabine de segurança para garantir condições de trabalho seguras e evitar a contaminação das culturas.
   1. Ressuspenda 1 ml de células descongeladas (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ células/ml) em 9 ml de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% (pré-aquecido a 37 °C) para um balão de cultura de células (25 cm²). Colocar o balão horizontalmente numa incubadora de cultura de células a 37 °C, 5% de CO₂.
   2. Cultivar as células a 37 °C e 5% de CO₂, até 70% de confluência. Isso normalmente deve ser alcançado após 24 - 48 h.
   3. Quando as células estiverem 70% confluentes, transfira a suspensão completa de células NLDC-145 (10 mL) para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL usando um controlador de pipeta com uma pipeta em uma faixa de volume de 1 a 10 mL. Pellet as células por centrifugação a 250 x g por 10 min à temperatura ambiente.
   4. Pré-aqueça o meio ISF-1 a 37 °C em banho-maria e ressuspenda o pellet em 12 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1%. Transferir a suspensão celular ressuspensa para um balão de cultura de células frescas (75^cm2).
   5. Cultivar e expandir as células em meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% a 37 °C e 5% de CO₂, até 70% confluente e 99% viável. Isso normalmente deve ser alcançado após 48 - 72 h.
   6. Dividir as células em dois balões de 75 cm². Para fazer isso, primeiro lave o fundo do frasco de cultura de células / superfície de cultura com a suspensão de células para remover todas as células NLDC-145 da superfície. Transfira 6 mL da suspensão de células NLDC-145 para um dos dois frascos novos de^{75 cm 2} e adicione meio ISF-1 pré-aquecido suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% até 12 mL.
      nota: Não renove o meio de cultura celular, pois as células NLDC-145 terão condicionado o meio. Transfira as células juntamente com o seu meio e encha a cultura até ao volume desejado com meio fresco. Isso é crucial para a viabilidade e produção máxima de anticorpos pelas células NLDC-145.
   7. Expandir as culturas celulares a 37 °C e 5% de CO₂, até cerca de 70% de confluência, o que é geralmente alcançado após 48 - 72 h.
   8. Quando as células estiverem 70% confluentes, transfira 10 mL da suspensão de células NLDC-145 expandida de cada um dos frascos de 75 cm² para um frasco de rolo PETG (polietileno tereftalato glicol) (1.050 cm²). Para isso, lave o fundo do frasco de cultura de células/superfície de cultura com a suspensão de células para remover todas as células da superfície usando um controlador de pipeta e uma pipeta de 10 mL.
   9. Adicione 140 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% (pré-aquecido a 37 °C) diretamente do frasco médio para cada um dos frascos contendo rolos NLDC-145, enchendo-os até a marca de 150 mL.
      nota: Consulte a nota na etapa 1.1.6.
   10. Cultive os frascos de rolo a 37 °C, 5% de CO₂ e 25 rodadas/min por três dias.
   11. Adicione 150 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos frascos de rolo contendo NLDC-145, enchendo-os até a marca de 300 mL.
   12. Cultive os frascos de rolo agora contendo 300 mL de cultura cada a 37 °C, 5% de CO₂ e 25 rodadas/min por mais três dias.
   13. Adicione mais 100 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina a 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos frascos de rolo contendo NLDC-145, enchendo-os até a marca de 400 mL.
   14. Cultive os frascos de rolo agora contendo 400 mL de cultura cada a 37 °C, 5% de CO₂ e 25 rodadas/min por mais sete dias.
       nota: Durante esta semana, a cultura fica muito densa (até 95% de densidade) e a viabilidade diminui (até 50%), permitindo a liberação máxima de anticorpos.
2. Para a purificação de αDEC-205 do sobrenadante de cultura, despeje a suspensão de células NLDC-145 (de ambos os frascos de rolo) diretamente em frascos de centrifugação autoclavados de 500 mL.
   nota: Um volume total de 800 mL de cultura deve ser coletado.
   1. Centrifugue a cultura durante 30 min a 8.600 x g e 4 °C para remover células e detritos.
   2. Colete os sobrenadantes, descartando os pellets e agrupando-os em um frasco de reagente estéril.
      nota: A purificação de αDEC-205 pode ser iniciada imediatamente (etapa 2.) ou o sobrenadante pode ser armazenado a curto prazo a 4 °C.

2. Purificação do anticorpo αDEC-205 do sobrenadante da célula NLDC-145

NOTA: A partir do sobrenadante celular NLDC-145, αDEC-205 é purificado usando uma coluna de proteína G Sepharose (reutilizável). As dimensões da coluna são 15 mm x 74 mm e 5 mL de proteína G Sepharose são embalados por coluna.

1. Para a preparação e lavagem da coluna de proteína G Sepharose, coloque um tampão de borracha hermético na abertura superior da coluna de proteína G Sepharose. Perfure o tampão de borracha com duas cânulas estéreis (20 G x 1 1/2", 0.90 x 40 mm).
   1. Conecte uma seringa de 10 mL a uma das duas cânulas e um tubo de silicone flexível (aproximadamente 100 cm de comprimento, 2,5 - 3 mm de diâmetro) com um conector de tubo à segunda cânula.
      nota: A construção da seringa/tampão de borracha é reutilizável e fornece um vácuo, resultando em um fluxo contínuo do grande volume de sobrenadante da cultura para a coluna de proteína G Sepharose. Para isso, puxe levemente o êmbolo da seringa para trás para garantir um fluxo contínuo de fluido nas etapas a seguir.
   2. Lave a coluna com 50 mL de ácido acético glacial 0,1 M (pH 2) para remover o anticorpo potencialmente remanescente de qualquer purificação anterior de anticorpos. Coloque a extremidade do tubo de silício no frasco de reagente cheio de ácido acético glacial (pH 2) 0.1 M. Como resultado do vácuo induzido, 50 mL do ácido acético glacial 0,1 M (pH 2) passam gota a gota pela coluna de proteína G Sepharose.
      NOTA: O ácido acético glacial 0,1 M (pH 2) deve ser armazenado em um frasco de reagente ou recém-enchido em um béquer.
   3. Lave a coluna com 100-200 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque a extremidade do tubo de silício em um frasco ou béquer de reagente cheio de PBS. Deixe 100-200 mL de PBS escorrerem gota a gota através da coluna de proteína G Sepharose.
2. Para purificação de anticorpos do sobrenadante NLDC-145, carregue 800 mL do sobrenadante NLDC-145 (obtido na etapa 1.2.2.) na coluna. Coloque a extremidade do tubo de silício no frasco de reagente cheio de sobrenadante NLDC-145. Deixe 800 mL NLDC-145 sobrenadante escorrer gota a gota através da coluna.
   1. Lave a coluna com 500 mL de PBS. Coloque a extremidade do tubo de silício em um frasco ou béquer de reagente cheio de PBS. Deixe 500 mL de PBS escorrer gota a gota pela coluna.
   2. Para eluição, use 20 tubos de 1,5 mL e pipete 100 μL de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) em cada tubo de 1,5 mL. Remova o tampão de borracha da coluna e pipete 1 mL de glicina 0,1 M (pH 3) para a câmara superior da coluna de proteína G Sepharose para eluir o anticorpo da coluna. Colete o fluxo diretamente como eluído em um dos tubos de 1,5 mL preparados.
   3. Repita a etapa de eluição (2.2.2.) para todos os 20 tubos (1,5 mL).
   4. Determinar a densidade óptica de todas as fracções de eluição a 280 nm (OD₂₈₀) utilizando um espectrofotómetro para identificar as fracções contendo anticorpos.
      nota: Utilizar a primeira fração de eluição como branco.
   5. Agrupe todas as frações com um OD₂₈₀ maior que 0,5 (aproximadamente 10 frações).
   6. Conservar a coluna de proteína G Sepharose preenchida com 20% de etanol a 4 °C.
3. Diálise das eluições combinadas contra 1000 ml de PBS (num copo de 2000 ml) a 4 °C durante a noite, utilizando tubos de diálise com um limite de peso molecular (MWCO) de 12 - 14 kDa.
   1. Corte o tubo de diálise em pedaços de 20 cm. Ferva o tubo de diálise em 500-800 mL de EDTA 10 mM (pH 7,5) por 30 min em um béquer usando uma placa quente para remover a contaminação. Descarte a solução de EDTA 10 mM (pH 7,5) e ferva o tubo de diálise em água deionizada por 10 min.
      nota: O tubo de diálise pode ser usado diretamente ou armazenado em solução de azida sódica (NaN₃)/H₂O a 0,01% a 4 °C até o próximo uso.
   2. Feche a parte inferior do tubo de diálise com um fechamento apropriado do tubo de diálise / peça única, braçadeira articulada e pipete cuidadosamente a eluição do anticorpo no tubo de diálise. Feche a parte superior do tubo de diálise com uma segunda braçadeira.
   3. Fixe o grampo superior do tubo de diálise em um suporte flutuante, coloque-o junto com uma barra de agitação magnética no copo cheio de PBS e coloque o copo em um agitador magnético.
   4. Dialize durante a noite, mexendo a 4 °C.
4. Para aumentar a concentração de αDEC-205, carregar o dialisado completo num concentrador centrífugo com 10 kDa MWCO. Abra uma braçadeira da tubulação e pipete cuidadosamente o dialisado completo da tubulação de diálise para o concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
   nota: Não toque no fundo do concentrador com a ponta da pipeta.
   1. Centrifugue por 30 min a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C.
   2. Carregue o concentrador centrífugo com 10 mL de PBS e centrifugue a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C até que o volume final da solução de anticorpos restante seja de 1-1,5 mL.
      nota: Se necessário, repetir a etapa de centrifugação de 2.4.1. para ajustar ao valor desejado.
   3. Com um espectrofotómetro, determinar a densidade óptica da solução concentrada de αDEC-205 a 280 nm (OD₂₈₀). Use PBS como espaço em branco.
   4. Calcular a concentração de αDEC-205 utilizando a seguinte fórmula:
      concentração [mg/mL] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Filtre a solução αDEC-205 usando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
      nota: A purificação de αDEC-205 do sobrenadante de células de hibridoma NLDC-145 também pode ser obtida por FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida). O αDEC-205 purificado pode ser armazenado a 4 °C ou a -18 °C para armazenamento a longo prazo.

3. Conjugação química de OVA para αDEC-205

NOTA: É necessária uma proporção de 0,5 mg de proteína OVA para 2,5 mg de αDEC-205 (1:5) para uma conjugação química ideal. No entanto, essa proporção pode variar para outras proteínas e anticorpos e precisa ser otimizada para conjugados alternativos. A redução das ligações dissulfeto da proteína OVA é realizada por meio de incubação com 30 mM de TCEP-HCl, que expõe os grupos sulfidrila para conjugação química a αDEC-205 e 240 μl de TCEP-HCl são necessários na etapa 3.2. Ambas as etapas, redução do OVA induzida por TCEP (etapa 3.1.) e ativação de sulfo-SMCC de αDEC-205 (etapa 3.2.) devem ser realizadas preferencialmente em paralelo.

1. Preparar uma solução de TCEP-HCl a 125 mM (pH 7,0). Pese a quantidade desejada de TCEP-HCl e dissolva o TCEP-HCl em base Tris 0,9 M (pH 8,8). Use tiras indicadoras de pH para testar o pH da solução 125 mM TCEP-HCl (que deve ser neutra) e ajuste o pH com a base Tris (pH 8.8).
   1. Pipete 200 μL de solução de proteína OVA (contendo 0,5 mg de OVA) para um tubo estéril de 1,5 mL. Adicionar 240 μl de TCEP-HCl 125 mM e 560 μL de água ultrapura estéril à proteína OVA usando uma pipeta até uma concentração final de 0,5 mg/mL de proteína OVA e 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg de EndoGrade OVA (liofilizado) são dissolvidos em 1 mL de PBS, resultando em uma solução de 2,5 mg / mL de OVA.
   2. Incubar o OVA/TCEP-HCl resultante à temperatura ambiente por 1,5 h.
      nota: Não estenda esta etapa de incubação.
2. Para ativar αDEC-205 para conjugação, dissolva 2 mg de sulfo-SMCC em 100 μL de água ultrapura.
   nota: Sulfo-SMCC é suscetível à hidrólise. Portanto, quantidades maiores de sulfo-SMCC não dissolvidas devem ser manuseadas rapidamente ou alíquotas de 2 mg disponíveis devem ser usadas.
   1. Diluir αDEC-205 em PBS de modo a que 2,5 mg estejam contidos em 900 μL.
   2. Misture 2,5 mg de αDEC-205 (volume de 900 μL; obtido na etapa 3.2.1.) e 100 μL de sulfo-SMCC (obtido na etapa 3.2.) em um tubo de 1,5 mL, resultando em um volume total de 1 mL.
   3. Incubar a solução αDEC-205/sulfo-SMCC durante 30 min a 37 °C e 550 rpm num bloco de aquecimento.
3. Após essas incubações, o excesso de sulfo-SMCC e TCEP-HCl é imediatamente removido das soluções usando colunas de dessalinização (MWCO 7 kDa; 5 mL de volume da coluna).
   1. Gire o fechamento inferior das colunas (MWCO 7 kDa), solte a tampa e coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mL.
   2. Centrifugue por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente para remover o líquido.
   3. Coloque a coluna em um novo tubo e remova a tampa. Carregue lentamente o anticorpo/sulfo-SMCC e o OVA/TCEP-HCl, respectivamente, no centro do leito compacto de resina de uma coluna cada.
   4. Centrifugue por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente.
   5. Descarte as colunas após o uso. As soluções contendo anticorpos e OVA preparados para conjugação estão nos tubos.
   6. Misture imediatamente ambas as soluções pipetando para conjugação de αDEC-205 e OVA.
   7. Incube a mistura resultante de αDEC-205 e OVA durante a noite a 4 ° C.
4. Após a conjugação, o excesso de OVA não ligado é removido da solução e o αDEC-205 / OVA acoplado é concentrado usando um concentrador de proteína centrífugo (MWCO 150 kDa).
   1. Pré-enxágue o concentrador centrífugo de proteínas (MWCO 150 kDa) pipetando 12 mL de PBS na coluna e centrifugando por 2 min a 2.000 x g à temperatura ambiente.
      nota: Se necessário, repetir a etapa de centrifugação (3.4.1.) até que um volume de cerca de 5 ml tenha passado através da coluna.
   2. Antes de carregar o αDEC-205/OVA no concentrador de proteínas centrífugo, guarde uma amostra de 20 μL do αDEC-205/OVA não concentrado para análise de western blot. Conservar esta alíquota a 4 °C até à análise.
   3. Carregue o αDEC-205/OVA no concentrador de proteínas centrífugo pipetando.
      nota: Evite qualquer contato com o leito da câmara superior do concentrador centrífugo.
   4. Encha o concentrador até 15 mL com PBS e centrifugue o concentrador por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
   5. Guarde uma amostra do fluxo contínuo (fluxo contínuo I) para análise de western blot e descarte o fluxo restante.
   6. Encha o concentrador até 10 mL com PBS e centrifugue o concentrador por pelo menos 8 min a 2.000 x g à temperatura ambiente.
   7. Guarde uma amostra para o segundo fluxo (fluxo II) para análise de western blot e descarte o fluxo restante.
   8. Uma vez alcançado o enriquecimento desejado (cerca de 1,5 mL da solução αDEC-205/OVA deve ser deixada na câmara superior), aspire suavemente a amostra concentrada.
      nota: Se sobrar muito líquido na câmara superior, a centrifugação pode ser repetida, mas deve ser mantida o mais curta possível.
5. Determinar a concentração proteica do αDEC-205/OVA resultante utilizando um espectrofotómetro de microvolumes. Use PBS como espaço em branco.
6. Filtre o αDEC-205/OVA usando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
   nota: Para análises posteriores e experimentos in vivo, αDEC-205/OVA pode ser armazenado a 4 °C ou -18 °C.

4. Verificação da conjugação química por ELISA

1. Realize ELISA para verificação adicional da conjugação química bem-sucedida, resultando em αDEC-205/OVA.
2. Cubra uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 μL / poço de anticorpo αOVA de coelho 3 ng / μL em tampão de revestimento (bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO₃) pH 9,6 diluído em H₂O).
   1. Incubar a placa durante a noite a 4 °C.
3. Após o revestimento, lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
4. Bloqueie a placa pipetando 200 μL de tampão de bloqueio (10% FCS em PBS) em cada poço da placa e incube a placa por 30 min à temperatura ambiente.
5. Dilua em série αDEC-205/OVA (obtido na etapa 3.6.) 1:2 em tampão de bloqueio (10% FCS em PBS) para obter diluições variando de 6 μg/mL até 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA e adicione 100 μL/poço dessas quantidades decrescentes de αDEC-205/OVA aos poços.
   1. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente.
6. Lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
7. Adicione 100 μL do anticorpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO de cabra (diluído a 1:2.000 em tampão de bloqueio (10% FCS em PBS)) a cada poço da placa.
   1. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
8. Lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
9. Adicione 50 μL de substrato HRPO aos poços. Ao observar uma reação de cor clara, interrompa a reação adicionando 150 μl de solução de parada (1M H₂SO₄) por poço.
10. Após 5 min, leia a absorção a 450 nm usando um leitor ELISA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão de bloqueio (ELISA)			10 % FBS em PBS
Balão de cultura celular T25	Greiner Bio-One	690175	usamos frascos de cultura de células com tampa de filtro padrão CELLSTAR; alternativamente, use frasco de cultura em suspensão (690195)
Balão de cultura de células T75	Greiner Bio-One	658175	usamos frascos de cultura de células com tampa de filtro padrão CELLSTAR; alternativamente, use frasco de cultura em suspensão (658195)
Balão de cultura celular T175	Greiner Bio-One	661175	usamos frascos de cultura de células com tampa de filtro padrão CELLSTAR; alternativamente, use frasco de cultura em suspensão (661195)
Concentrador centrífugo MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Concentrador centrífugo Vivaspin 20
Concentrador centrífugo de proteínas MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Científico	Rolamento 88532	Concentrador de Proteínas Pierce, PES 5 -20 ml; usamos o Concentrador Pierce 150K MWCO 20mL (número de catálogo 89921), que no entanto não está mais disponível
Garrafas de centrífuga	Nalgene	Rolamento 525-2314	PPCO (copolímero de polipropileno) com fecho de rosca PP (polipropileno), 500 ml; obtido da VWR, Alemanha
Tampão de revestimento (ELISA)			0,1 M de bicarbonato de sódio (NaHCO3) em H2O (pH 9,6)
Colunas de dessalinização MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Científico	Rolamento 89891	Colunas de Dessalinização Spin Zeba da Thermo Scientific, 7K MWCO, 5 mL
Reagente de detecção ELISA (substrato HRPO)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	Sistema de substrato líquido de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB)
Placa ELISA de 96 poços	Thermo Fisher Científico	442404	Placa MaxiSorp Nunc-Immuno
Soro fetal de bezerro	PAN-BIOtech	Pág. 40-47500	FBS Bom forte
Meio ISF-1	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
NLDC-145 hibridoma	ATCC	HB-290	se ainda não estiver disponível, as células do hibridoma podem ser adquiridas do ATCC
Ovalbumina	Hyglos (via BioVendor)	Rolamento 321000	EndoGrade OVA ultrapuro com <0,1 UE/mg
Penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140122	Penicilina Gibco/Estreptomicina 10.000 U/ml; alternativamente Penicilina/Estreptomicina 5.000 U/ml (15070-063) pode ser usada
Frascos de rolo de cultura de células de tereftalato glicol de polietileno PETG	Nunc In Vitro	734-2394	revestido com PDL padrão, ventilado (1,2 X), 1050 cm², volume de 100 - 500 ml; obtido da VWR, Alemanha
Tiras indicadoras de pH	Merck	109535	Tiras indicadoras de pH 0-14
Anticorpo policlonal αrat-IgG+IgM-HRPO de cabra (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtido de Dianova, Alemanha; usado em 1:2000 para ELISA
αOVA policlonal de coelho (ELISA)	Abcam	AB181688	Usado a 3 ng/μl
Coluna de Sepharose Protein G	Merck/Millipore	Pág. 3296	5 ml de proteína G Sepharose, Fast Flow são embalados em uma coluna vazia PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Tampão de borracha	Omnilab	5230217	Rolhas de borracha DEUTSCH & NEUMANN (inferior Φ 17 mm; superior Φ 22 mm)
Tubo de silicone	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (interior Φ 1 mm; exterior Φ 3 mm)
Slim-Fast			usamos o Slim-Fast Chocolate regular disponível gratuitamente na farmácia, pois nesta abordagem de western blot produziu melhores resultados do que o leite em pó
Solução de parada (ELISA)			1M H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Científico	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternativamente, use o número de catálogo A39268 (10 x 2 mg)
Unidade de filtro de seringa 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Unidade de filtro de seringa Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, esterilizada por gama
Seringa 10 ml	Omnilab		Seringas descartáveis Injekt® Solo B.Braun
Cânulas Sterican®	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0,90 x 40 mm; amarelo
TCEP-HCl	Thermo Fisher Científico	Resposta A35349
Conector de tubulação	Omnilab		Conectores de tubos em miniatura Kleinfeld para tubo de silicone