Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Resumo

Fonte: Ji, Y., et al. Uma abordagem de ensaio cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Protocolo

1. Preparação de materiais para o ensaio cometa

1. Preparação das lâminas de microscópio
   1. Despeje 1% (p / v) de agarose de ponto de fusão normal [dissolvida em água bidestilada (ddH₂O)] em um tubo de 50 mL e leve ao microondas para dissolver a agarose no ddH₂O. Armazene a 37 ° C para evitar a solidificação antes de revestir as lâminas. Caso ocorra solidificação, descarte e prepare fresco.
   2. Pré-revestir as lâminas do microscópio mergulhando-as no tubo de 50 mL contendo 1% (p / v) de agarose de ponto de fusão normal.
   3. Limpe a parte de trás dos slides rapidamente depois de mergulhá-los.
      nota: A falha em limpar a parte de trás das lâminas corretamente aumentará o ruído de fundo das lâminas durante a etapa de análise pelo microscópio.
   4. Rotule a lâmina revestida com um marcador permanente no canto inferior direito da seção fosca (Figura 1A). Isso mostra qual lado do slide é pré-revestido.
   5. Deixe a agarose endurecer e secar durante a noite em temperatura ambiente.
   6. Embrulhe as lâminas secas em papel de seda e guarde-as em uma caixa.

2. Preparação das amostras

1. Células cultivadas
   nota: Em primeiro lugar, trate as células com o(s) agente(s) prejudicial(is) antes de iniciar o ensaio cometa. Em seguida, execute o seguinte.
   1. Se as células estiverem aderentes, tripsinizar as células para liberá-las do frasco de cultura de células ou placas de Petri de cultura de células, na confluência apropriada de células. Neutralize a tripsina adicionando meios contendo soro.
   2. Transfira as células para um tubo de 50 mL, centrifugue (por exemplo, para HaCaTs, centrifugue a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente), remova suavemente o sobrenadante e adicione 1 mL de PBS ao pellet da célula.
   3. Execute a contagem de células.
   4. Transfira 30.000 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 7.607 x g por 5 min a 4 ° C.
   5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e armazene o pellet celular no gelo no escuro antes de realizar o ensaio do cometa.
      nota: As células devem ser testadas regularmente quanto à contaminação por Mycoplasma antes de realizar o ensaio cometa para prevenir, entre outros efeitos, a formação de danos ao DNA artefactual e resposta alterada ao dano ao DNA, conforme relatado. As condições de centrifugação podem ser alteradas, conforme necessário, dependendo do tipo de célula utilizada.
2. Preparação de células cultivadas para ensaio de reparo
   1. Células de cultura no balão de cultura de células ou placas de Petri.
   2. Lave as células com 1 mL de PBS duas vezes antes de tratá-las com agentes prejudiciais (por exemplo, para células BE-M17, trate com 50 μM de H₂O₂ por 20 min) em gelo para evitar que o reparo ocorra durante o tratamento.
   3. Lave as células suavemente com 1 mL de PBS duas vezes para remover quaisquer agentes prejudiciais residuais.
   4. Reintroduza o meio de cultura celular e permita que as células se reparem por durações variadas (por exemplo, 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h e 30 h) em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO₂).
   5. Em cada momento, recolher 30.000 células em meio de cultura de células contendo dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% e armazená-las a -80 °C.
   6. Antes de realizar o ensaio cometa, descongelar as células rapidamente a 37 °C em banho-maria e centrifugá-las a 7.607 x g durante 5 min a 4 °C.
   7. Remova o sobrenadante e armazene o pellet celular no gelo antes de realizar o ensaio (ou seja, da etapa 3).

3. Lise celular

NOTA: Realize todos os procedimentos no gelo.

1. Use 12.000 células ou 2,5 μL de sangue total por gel.
2. Prepare agarose de baixo ponto de fusão a 0,6% (p / v) dissolvida em PBS usando um micro-ondas e coloque em banho-maria a 37 ° C para evitar que solidifique.
3. Rotule a extremidade fosca das lâminas pré-revestidas com o nome, data e informações de tratamento do investigador usando um marcador ou lápis permanente.
4. Coloque uma placa de resfriamento em uma bancada plana e insira as duas bolsas de resfriamento congeladas na gaveta deslizante abaixo da superfície metálica (conforme mostrado na Figura 2).
5. Coloque as lâminas na placa de resfriamento e deixe-as pré-esfriar por 1-2 min antes de adicionar as células contendo agarose de baixo ponto de fusão a 0,6% (p / v><). nota: Deixar as lâminas na placa de resfriamento por mais de 1-2 min pode causar a formação de condensação na superfície da lâmina devido à umidade ambiente. Isso pode tornar os géis de agarose de baixo ponto de fusão menos estáveis nas lâminas.
6. Dispersar o pellet (passo 2.2.7) por vórtice. Certifique-se de que todo o sobrenadante foi removido do pellet. Coloque os tubos de amostra (contendo as células peletizadas) imediatamente de volta no gelo.
   nota: Ao colocar os tubos contendo samples na centrífuga, coloque-os com a dobradiça voltada para fora para que o pellet seja coletado deste lado do tubo. Às vezes é difícil ver o pellet e é fácil desalojá-lo enquanto remove o sobrenadante. Centrifugar com a tampa do tubo nesta orientação permitirá saber onde estará o pellet celular.
7. Ressuspenda o pellet celular com 200 μL de agarose de baixo ponto de fusão a 0,6% (agarose LMP) e misture pipetando para cima e para baixo sem criar bolhas. Em seguida, transfira rapidamente 80 μL de células contendo agarose LMP para uma lâmina gelada e coloque rapidamente uma lamínula no gel.
8. Deixe o gel endurecer na placa de resfriamento por 1-2 min.
9. Enquanto isso, prepare uma solução de trabalho de 500 mL de tampão de lise (Tabela 1) e despeje-a na placa de lise (Figura 3).
10. Uma vez que os géis tenham sido definidos, remova as lamínulas rapidamente, segurando suavemente a lâmina entre o polegar e o indicador e deslizando a lamínula para fora do gel.
11. Coloque as lâminas contendo amostras dentro do suporte de lâminas (todas as marcas de "ponto" preto nas lâminas devem estar voltadas para a mesma direção quando forem colocadas em um suporte) (Figura 1B) e, em seguida, coloque o suporte de lâminas dentro da placa de lise (Figura 3).
12. Feche a tampa da placa de lise e mantenha-a na geladeira durante a noite a 4 °C ou 30 min em temperatura ambiente, o que melhor se adequar ao horário do operador.

4. Eletroforese

1. Remova cuidadosamente o suporte da lâmina do prato de lise. Tome cuidado para não perturbar os géis.
2. Coloque cuidadosamente o suporte da corrediça em uma assadeira pré-carregada com ddH₂O gelado e deixe-a por 30 min, certificando-se de que as lâminas estejam completamente cobertas com ddH₂O.
3. Insira um pacote de resfriamento congelado dentro da gaveta deslizante sob o tanque de eletroforese para manter a temperatura ideal do buffer.
4. Adicione cuidadosamente a solução de trabalho de eletroforese gelada (Tabela 1) ao tanque de eletroforese e transfira o suporte da lâmina para o tanque de eletroforese. Oriente as lâminas de forma que suas partes transparentes com os géis contendo células (ou seja, NÃO as extremidades foscas / de rotulagem) apontem para o cátodo (eletrodo vermelho).
5. Deixe as lâminas no tanque de eletroforese por 20 minutos para que o DNA relaxe e relaxe. Mantenha a fonte de alimentação desligada durante esta etapa.
6. Se necessário, insira um novo pacote de resfriamento congelado para maximizar o resfriamento.
7. Realize eletroforese por 20 min a 1,19 V/cm, ou quaisquer condições que tenham sido otimizadas.
   nota: A otimização das condições de execução da eletroforese e do volume de tampão é recomendada para todos os laboratórios. O uso de apenas um único suporte de lâmina durante a eletroforese não causa nenhum efeito das lâminas na resistência do tampão de eletroforese, e os autores não viram um efeito significativo na tensão ou corrente quando o número de lâminas mudou.
8. Desligue a fonte de alimentação, remova cuidadosamente o suporte da lâmina do tanque de eletroforese e deixe-o escorrer em papel de seda por 30 s.
9. Coloque o suporte deslizante no prato contendo o tampão de neutralização (Tabela 1). Deixe agir por 20 min.
10. Remova o suporte deslizante do prato de neutralização, coloque-o no prato de lavagem contendo ddH2O gelado e deixe por 20 min.
11. Remova o suporte de lâminas da água e deixe-as secar em uma incubadora a 37 °C por 1 h, ou em temperatura ambiente durante a noite, ou não seque, dependendo da programação do operador.
    nota: Se não houver secagem na etapa 4.11, execute a etapa de coloração de 5.2.

5. Coloração de iodeto de propídio (PI)

1. Transfira o suporte da lâmina para uma travessa contendo ddH₂O gelada para reidratar as lâminas e deixe por 30 min.
2. Coloque o suporte da lâmina em um recipiente de coloração contendo 2,5 μg / mL de solução de iodeto de propídio.
   nota: O iodeto de propídio é sensível à luz, portanto, manuseie-o em uma área escura. Também é tóxico.
3. Feche a tampa da mancha e incube-a por 20 min no escuro em temperatura ambiente.
4. Transfira o porta-lâminas para um prato separado e lave-o com ddH₂O gelado por 20 min.
5. Remova o suporte deslizante do prato e seque-o completamente no escuro, em uma incubadora a 37 °C ou em temperatura ambiente, dependendo da programação ou preferência do operador.
6. Quando as lâminas estiverem totalmente secas, remova-as do suporte da lâmina e guarde-as em uma caixa de lâminas no escuro até que estejam prontas para análise de imagem.
   nota: Os slides permanecerão legíveis indefinidamente e podem ser corados novamente, se necessário.

6. Pontuação cometa e análise de dados

NOTA: O termo "cometa" deriva das imagens de células danificadas quando vistas ao microscópio após a realização do ensaio (Figura 4). Sob condições de eletroforese, o DNA nas células não danificadas não migra em grande parte, mas permanece em um esferóide denominado "cabeça" de cometa. No entanto, a presença de quebras de fita permite que o DNA da célula migre para fora da cabeça e forme uma "cauda", levando a uma aparência semelhante a um cometa (Figura 4). Quanto mais DNA na cauda, mais danos estão presentes.

1. Ligue o microscópio de fluorescência com o filtro PI (vermelho) (λ = 536/617 nm) e o software de pontuação do ensaio cometa.
2. Adicione uma gota de água usando uma pipeta Pasteur ao gel e cubra com uma lamínula.
3. Coloque as lâminas no microscópio de fluorescência e "marque" os cometas.
   nota: A pontuação é um meio pelo qual os cometas são avaliados, para determinar a quantidade de danos presentes em cada cometa. Em termos gerais, isso pode ser alcançado usando duas abordagens, de acordo com a preferência escolhida pelo usuário, seja a olho nu (medindo o tamanho dos cometas em uma escala de zero a quatro) ou usando software disponível gratuitamente ou comercialmente30. Geralmente, ambas as abordagens avaliam o tamanho da cauda do cometa, embora uma variedade de pontos finais relacionados ao cometa possam ser determinados. Se estiver usando o software, clique no meio da cabeça do cometa e espere até que o software detecte o cometa automaticamente e, em seguida, avalie o ponto final escolhido (Figura 4).
4. Marque 50 cometas por gel e 100 cometas por amostra (ou seja, cada amostra correspondendo a diferentes tratamentos prejudiciais ao DNA ou suas réplicas).
5. Replicar os experimentos (n = 2) ou triplicar os experimentos (n = 3).
   nota: Se apenas n = 2 experimentos replicados forem realizados, a análise estatística não pode ser realizada, mas se n = 3, execute o teste de normalidade de D'agostino. A maioria dos dados de ensaios cometas não passa em um teste de normalidade. Nesse caso, use um teste não paramétrico (teste de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn e teste de significância de Mann-Whitney definido em p < 0,05).

Reagente	Solução de estoque	Solução de trabalho
Tampão de lise	100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl e 10 mM Tris Base em ddH2O; ajustar o pH para 10 com 10 M NaOH	Triton X-100 a 1% em solução de estoque de lise
Tampão de eletroforese	10 M NaOH e 200 mM Na2EDTA em ddH2O	300 mM de NaOH e 1 mM de Na2EDTA; pH > 13
Tampão de neutralização	0,4 M Tris Base em ddH2O; ajuste o pH para 7,5 com HCl
Tampão de coloração	1 mg/ml de iodeto de propídio	2,5 μg/mL de iodeto de propídio em ddH2O

Tabela 1: Composição dos reagentes usados no ensaio de cometa alcalino de alto rendimento (HTP ACA). As concentrações de estoque e trabalho de lise, eletroforese, neutralização e tampões de coloração são mostradas.

Resultados

Figura 1: Imagens representativas de uma lâmina de ensaio de cometa e rack HTP (portador de lâmina de microscópio). (A) Para uma orientação correta, a face pré-revestida da lâmina do microscópio é reconhecida por um ponto preto no canto direito de uma lâmina do microscópio. (B) A imagem do rack HTP ilustra como as lâminas são mantidas em uma orientação vertical apertada, com abas no suporte para fixa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas de vidro de 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	Nº 631-0124
Microscópio de fluorescência equipado com uma câmera	Zeiss, Jena, Alemanha
Sistema HTP Comet Assay	Cutelo Científico	COMPAC- 50
Queratinócitos humanos (HaCaTs)	Coleção American Type Culture (ATCC), Manassas, VA, EUA	Descontinuado	Pode ser comprado em outro empresa ADDEXBIO TECHNOLOGIES Gato # T0020001
Peróxido de hidrogênio (H2O2) 30% em água	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	BP2633-500
Software de análise de imagem e dados	Instrumento Perceptivo, Bury St Edmunds, Inglaterra, Reino Unido	125525	O software gratuito de análise de imagens is disponível, por exemplo, ImageJ
Baixo ponto de fusão Agarose	Invitrogen Waltham, MA, EUA	Pág. 4864
Na2 EDTA (dissódico ácido etilenodiaminotetracético)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	E5134
NaCl (cloreto de sódio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	S7653
Nanopure Infinity Água Ultrapura Sistema (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA	D11901	Água ultrapura (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (hidróxido de sódio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	E5134
Ponto de fusão normal Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	16520100	Para lâminas de pré-revestimento
Iodeto de propídio (1,0 mg/ml em água)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	12-541BP486410ML
Microscópio de vidro fosco simples Slides	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	12-541B
Caixa de slides	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	03-448-2	À prova de luz, para proteger as células de a formação dano adventício (de acordo com a visão amplamente difundida) e evitar o desbotamento do fluorescente tingir
Placa de resfriamento deslizante	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	CSL-CHILLPLATE
Prato de tratamento	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	Rolamento 93362
Tritão X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	BP151-500
Tripsina EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, EUA	15400054
Portador vertical da corrediça	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	COMPAC-25