Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Resumo

Fonte: Ji, Y., et al. Uma abordagem de ensaio cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Protocolo

1. Preparação de materiais para o ensaio cometa

1. Preparação das lâminas de microscópio
   1. Despeje 1% (p / v) de agarose de ponto de fusão normal [dissolvida em água bidestilada (ddH₂O)] em um tubo de 50 mL e leve ao microondas para dissolver a agarose no ddH₂O. Armazene a 37 ° C para evitar a solidificação antes de revestir as lâminas. Caso ocorra solidificação, descarte e prepare fresco.
   2. Pré-revestir as lâminas do microscópio mergulhando-as no tubo de 50 mL contendo 1% (p / v) de agarose de ponto de fusão normal.
   3. Limpe a parte de trás dos slides rapidamente depois de mergulhá-los.
      nota: <....

Resultados

Figura 1: Imagens representativas de uma lâmina de ensaio de cometa e rack HTP (portador de lâmina de microscópio). (A) Para uma orientação correta, a face pré-revestida da lâmina do microscópio é reconhecida por um ponto preto no canto direito de uma lâmina do microscópio. (B) A imagem do rack HTP ilustra como as lâminas são mantidas em uma orientação vertical apertada, com abas no suporte para fixa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas de vidro de 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	Nº 631-0124
Microscópio de fluorescência equipado com uma câmera	Zeiss, Jena, Alemanha
Sistema HTP Comet Assay	Cutelo Científico	COMPAC- 50
Queratinócitos humanos (HaCaTs)	Coleção American Type Culture (ATCC), Manassas, VA, EUA	Descontinuado	Pode ser comprado em outro empresa ADDEXBIO TECHNOLOGIES Gato # T0020001
Peróxido de hidrogênio (H2O2) 30% em água	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	BP2633-500
Software de análise de imagem e dados	Instrumento Perceptivo, Bury St Edmunds, Inglaterra, Reino Unido	125525	O software gratuito de análise de imagens is disponível, por exemplo, ImageJ
Baixo ponto de fusão Agarose	Invitrogen Waltham, MA, EUA	Pág. 4864
Na2 EDTA (dissódico ácido etilenodiaminotetracético)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	E5134
NaCl (cloreto de sódio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	S7653
Nanopure Infinity Água Ultrapura Sistema (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA	D11901	Água ultrapura (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (hidróxido de sódio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	E5134
Ponto de fusão normal Agarose	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	16520100	Para lâminas de pré-revestimento
Iodeto de propídio (1,0 mg/ml em água)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	12-541BP486410ML
Microscópio de vidro fosco simples Slides	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	12-541B
Caixa de slides	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	03-448-2	À prova de luz, para proteger as células de a formação dano adventício (de acordo com a visão amplamente difundida) e evitar o desbotamento do fluorescente tingir
Placa de resfriamento deslizante	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	CSL-CHILLPLATE
Prato de tratamento	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA	Rolamento 93362
Tritão X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA	BP151-500
Tripsina EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, EUA	15400054
Portador vertical da corrediça	Cutelo Científico, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	COMPAC-25