O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia de um comitê de segurança designado em cada instituição.
1. Absorção de aminoácidos nas células
- Placa 5 x 104 células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Células da placa em α-MEM contendo 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina e 0,1 μg / mL de estreptomicina (Pen / Strep). Plaquear poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações na etapa 1.12. Incubar células em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 ° C com 5% de CO 2 .
- Cultive as células por 2-3 dias até ficarem confluentes.
- No dia do experimento, prepare as seguintes soluções: 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 e tampão Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM de D-glicose). Pré-aqueça a 37 °C.
- Aspire o meio e lave as células duas vezes com 1 mL de PBS 1x, pH 7,4.
NOTA: Este protocolo também é apropriado para a divisão rápida de células não confluentes. Nesse caso, é importante normalizar a radioatividade para o número absoluto de células ou conteúdo de DNA. Além disso, considere aumentar o tamanho da placa de cultura ou frasco para aumentar o número geral de células e os valores de cpm. Isso é importante para determinar empiricamente em uma base individual.
- Aspire 1x PBS e lave as células uma vez com 1 mL de KRH.
- Produzir 4 μCi/mL L-[3,4-3H]-Meio de trabalho de glutamina diluindo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3H]-estoque de glutamina por 1 mL de KRH.
NOTA: Antes de usar materiais radioativos, entre em contato com o Escritório de Segurança contra Radiação de sua instituição de origem para obter aprovações. Todos os procedimentos relacionados à radiação devem ser realizados atrás do escudo de plexiglass.
- Incubar células com 0,5 mL de KRH contendo 4 μCi/mL L-[3,4-3H]-Meio de trabalho de glutamina por 5 min.
- Recolha o meio radioativo e distribua no recipiente de resíduos líquidos. Lave as células três vezes brevemente com KRH gelado para interromper a reação. Recolha e elimine todas as lavagens no recipiente de resíduos líquidos radioactivos.
- Adicione 1 mL de SDS a 1% em cada poço e triture 10x para lisar e homogeneizar as células. Transfira os lisados celulares para tubos de 1,5 mL. Descarte as placas de cultura de células, pipetas sorológicas e pontas de pipeta no recipiente de resíduos radioativos sólidos.
- Centrifugue a >10.000 x g por 10 min. Transfira os sobrenadantes para frascos para injetáveis de cintilação contendo 8 ml da solução de cintilação. Misture agitando vigorosamente os frascos para injetáveis de cintilação. Descarte os tubos e as pontas das pipetas no recipiente de resíduos radioativos sólidos.
- Leia a radioatividade em contagens por minuto (cpm) usando um contador de cintilação. Descarte os frascos para injetáveis de cintilação no recipiente de resíduos do frasco para injetáveis de cintilação.
- Tripsinize, ressuspenda e conte as células das placas não radioativas restantes (consulte a etapa 1.1) para estimar o número de células nas culturas radioativas lisadas. Usando um hemocitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental. Normalize o cpm da etapa 1.11 para o número estimado de células das placas não radioativas.
- Após a conclusão do experimento, descontamine a capa de cultura de células, a bancada e todos os instrumentos com um spray descontaminante de radioatividade. Por fim, realize testes de limpeza para garantir que a área de trabalho esteja livre de radiação.
