Ensaio de captação de aminoácidos radiomarcados para quantificar a captação celular de aminoácidos

Resumo

Fonte: Shen, L., et al. Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Hastes Ósseas Isoladas. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estimar a absorção de aminoácidos por células estromais derivadas da medula óssea. Os transportadores de aminoácidos dependentes de Na⁺ medeiam a captação de aminoácidos radiomarcados dentro das células, e a captação celular é estimada medindo a radioatividade.

Protocolo

O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia de um comitê de segurança designado em cada instituição.

1. Absorção de aminoácidos nas células

1. Placa 5 x 10⁴ células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Células da placa em α-MEM contendo 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina e 0,1 μg / mL de estreptomicina (Pen / Strep). Plaquear poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações na etapa 1.12. Incubar células em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 ° C com 5% de CO ₂ .
2. Cultive as células por 2-3 ....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina	Gibco	25200
Placa de 12 poços	Corning	3513
Beckman LS6500 contador
Cloreto de cálcio	Sigma	C1016
cloreto de colina	Sigma	C7077
Solução de D-(+)-glicose	Sigma	G8769
DPBS	Gibco	14190
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamina	PerkinElmer	NET551250UC
Frascos de cintilação líquida	Sigma	Z190535
solução de cloreto de lítio, 8M	Sigma	L7026
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
MEM&alfa;	Gibco	12561
, 15mL	Biotix	89511-256
Cloreto de potássio	Sigma	P3911
Bicarbonato de sódio	Sigma	S6014
cloreto de sódio	Sigma	S9888
Dodecil sulfato de sódio	Sigma	436143
Ultima Gold (cintilação solução)	PerkinElmer	6013329
&alfa; - (Metilamino) ácido isobutírico	Sigma	M2383

de cintilaçãoTubo de microcentrífuga