Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

Resumo

Fonte: Yanase, S., et al. Ensaios colorimétricos em pequena escala de lactato e piruvato intracelular no nematóide Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Protocolo

1. Cultura sincronizada de C. elegans

1. Antes da semeadura, cultive a cepa OP50 de Escherichia coli (E. coli) durante a noite a 37 °C em 300 mL de meio líquido de caldo Luria-Bertani (LB). Conservar a OP50 cultivada a -4 °C.
   1. Para fazer meio líquido de caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de NaOH 1 N e adicione a 1 L com água deionizada. Autoclave.
      nota: As cepas OP50 e C. elegans estão disponíveis no Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, EUA).
2. Para fazer ágar meio de crescimento de nematóides (NGM), use 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar e 975 mL de água deionizada. Autoclave. Resfrie a 55 ° C e, em seguida, adicione estérilmente, em ordem, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 5 mg / mL de colesterol em EtOH e 25 mL de fosfato de potássio 1 M pH 6,0 em placas de Petri de 90 mm.
   1. Para fosfato de potássio 1 M pH 6,0, use 108,3 g de KH₂PO₄ e 46,6 g de K₂HPO₄ e adicione água deionizada a 1 L. Autoclave.
3. Espalhe 1-2 mL do OP50 cultivado nas placas de ágar NGM. Para fazer uma fina camada de OP50, incube as placas durante a noite em temperatura ambiente antes de adicionar qualquer nematóide.
   nota: As placas de ágar NGM inoculadas OP50 podem ser armazenadas em temperatura ambiente por 2-3 semanas.
4. Adicionar pelo menos 100 minhocas numa placa de ágar NGM com OP50 e cultivar a 20 °C até à fase adulta. São necessárias pelo menos três placas.
5. Para coletar ovos no útero, transfira hermafroditas gravídicos das três placas de ágar NGM, cada uma com 5 mL de tampão S em um tubo cônico de 15 mL, e lave os vermes 3 vezes com 15 mL de tampão S usando centrifugação a 300 x g por 30 s à temperatura ambiente.
   1. Para fazer tampão S, use 5,9 g de NaCl e 50 mL de fosfato de potássio 1 M pH 6,0 e adicione a 1 L com água deionizada. Autoclave.
6. Dissolva os vermes em uma solução alcalina de hipoclorito para axenização e isolamento de ovos a granel (0,5 mL de alvejante fresco ou equivalente: 5-6% de hipoclorito de sódio, 0,1 mL de NaOH 10 M, aproximadamente 4,5 mL de tampão S) e deixe a solução por 10-15 min em temperatura ambiente com mistura por inversão.
   nota: Dentro de 15 minutos, os vermes adultos devem se dissolver, deixando uma solução turva de ovos liberados de suas carcaças (os ovos liberados devem ser confirmados usando um microscópio estereoscópico). Em vez de 0,1 mL de NaOH 10 N, também pode ser usado 0,2 mL de NaOH 5 N.
7. Após o tratamento com hipoclorito, lave o pellet de ovo 3 vezes com 15 mL de tampão S e ressuspenda em 5-6 mL de tampão S. Chocar os ovos libertados durante uma incubação noturna a 20 °C em tampão S sem E. coli para uma cultura sincronizada com a idade de larvas da fase L1.
8. Para determinar o número aproximado de larvas do estágio L1, conte os vermes usando um microscópio estereoscópico em 10 μL de tampão S após ressuspender as larvas pelo menos 3 vezes e calcule a média. Em seguida, transfira as larvas do estágio L1 para cinco placas de ágar NGM com OP50 (1.500-3.000 vermes por placa usando uma placa de Petri de 90 mm) e cultive a 20 ° C até que tenham crescido até o estágio de adulto jovem, quando a autofecundação começa e alguns ovos são postos (normalmente após 3 dias).

2. Extração da Fração Celular de C. elegans

1. Colete os vermes do estágio adulto jovem (animais com 5 dias de idade) das cinco placas de ágar NGM com tampão S (Figura 1A).
   1. Para selecionar apenas vermes vivos usando o método de sacarose 6 para flotação em sacarose a 30% (p / v), misture os vermes suspensos em 3-4 mL de tampão S com um volume igual de sacarose gelada a 60% (p / v) em um tubo cônico de 15 mL. Gire o tubo a 1.500 x g por 15 s a 4 ° C e remova os vermes flutuantes em um tubo novo, movendo-os para fora da parede do tubo com uma pipeta Pasteur.
2. Lave os vermes 3 vezes com tampão S por centrifugação a 1.500 x g por 30 s a 4 ° C. Verifique o volume úmido dos vermes lavados após a centrifugação usando uma ponta de micropipeta de 1.000 μL (Figura 1B).
3. Adicione os vermes lavados a um volume igual de ácido tricloroacético (TCA) a 10% (p / v) gelado para precipitação de proteínas (Figura 1C). Em vez de TCA, pode-se usar ácido perclórico (PCA) ou ácido metafosfórico.
4. Homogeneizar as minhocas com o precipitante usando 40 golpes de pilão em um homogeneizador de Teflon (moedor de tecidos Potter-Elvehjem) com rotação de até 1.300 rpm no gelo.
5. Transfira o homogeneizado para um microtubo fresco de 1,5 mL com uma pipeta Pasteur e sonice usando um homogeneizador ultrassônico por 3 min (3 vezes de 1 min) com um ciclo de trabalho de 20% no gelo.
6. Claree o homogeneizado por centrifugação a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Neutralize os sobrenadantes com 4 M KOH (0,25 volume a 10% de TCA) por 20 min em gelo e centrifugue a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante (como amostra de ensaio) pode ser armazenado a -80 °C até aos ensaios seguintes.

3. Ensaio de lactato usando um kit de ensaio colorimétrico

1. Medir a concentração de lactato nas amostras de ensaio utilizando um kit de ensaio colorimétrico (Tabela de Materiais). Efectuar exames duplex para as amostras de ensaio. Adicione 5 ou 10 μL das amostras de teste a uma placa de 96 poços e ajuste o volume para 50 μL por poço com o tampão de ensaio de lactato fornecido com o kit.
2. Para a curva padrão de lactato, diluir 100 mM L (+) -Lactato Padrão para 1 mM com tampão de ensaio de lactato. Adicione 0, 2, 4, 6, 8 e 10 μL do padrão de lactato de 1 mM L (+), que é fornecido com o kit, em uma série de poços.
3. Adicione 50 μL de mistura de reação (contendo 46:2:2 de tampão de ensaio de lactato, mistura enzimática de lactato e sonda de lactato em DMSO, anidro; todos os reagentes são fornecidos com o kit) ou mistura de controle de fundo (contendo 48:2 de tampão de ensaio de lactato e sonda de lactato) em cada poço e incube em temperatura ambiente por 30-60 min enquanto as amostras são protegidas da luz.
4. Meça a absorbância de cada poço a 570 nm usando um leitor de microplacas e subtraia a absorbância da mistura de controle de fundo da absorbância da mistura de reação.
5. Traçar a curva padrão de lactato. Calcular as concentrações de lactato das amostras de ensaio a partir da curva padrão de lactato.

Resultados

Figura 1. Processo de extração de metabólitos celulares. (A) 1.500-3.000 vermes foram colocados em uma placa de ágar NGM (placa de Petri de 90 mm). A extração de minhocas em cinco placas foi suficiente para os ensaios colorimétricos. (B) Os vermes coletados das cinco placas de 3.000 e 1.500 vermes por placa são indicados no lado esquerdo e direito do...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ensaio colorimétrico/fluorimétrico de lactato	BioVisão	#K607-100	Colorimétrico/fluorimétrico 100 ensaios; Armazene a -20oC
Ácido tricloroacético	Wako Pure Chemical	#207-04955	Armazene em temperatura ambiente
Homogeneizador de teflon	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Em vez de Iwaki/Pyrex disponível pela Wheaton