Ensaio espectrofotométrico para determinar a atividade da glicogênio sintase

Resumo

Fonte: Wilson W.A., Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve um ensaio espectrofotométrico para a estimativa da atividade da glicogênio sintase. O método baseia-se na redução da absorbância do NADH com o tempo e indica a atividade da glicogênio sintase.

Protocolo

1. Determinação da atividade da glicogênio sintase

1. Preparar as soluções-mãe dos reagentes necessários conforme indicado no quadro 1 (antes do dia experimental).
2. No dia do ensaio, prepare uma nova solução de trabalho de 4 mM de NADH dissolvendo 4,5 mg de NADH em 1,5 mL de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Armazene no gelo, protegido da luz.
3. Descongele as soluções estoque de UDP-glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP quinase em gelo.
4. Pré-aqueça um banho-maria a 30 °C.
5. Configure cada ensaio de glicogênio sintase em um tubo de 1,5 mL adicionando os reagentes da mistura de reação listados na Tabela 2.
   nota: Para facilitar a configuração, pode ser feita uma mistura principal contendo o suficiente de cada um dos reagentes listados acima para completar o número de ensaios planejados.
6. Prepare uma reação em branco, onde o NADH na mistura acima é substituído por água. Transferir para uma cubeta de metacrilato descartável e utilizá-la para definir o zero no espectrofotómetro a 340 nm.
7. Pegue 770 μL da alíquota da mistura de reação em um tubo de 1,5 mL. Adicione 2 μL de NDP quinase e 2 μL de mistura de piruvato quinase / lactato desidrogenase, misture delicadamente e incube a 30 ° C por 3 min para pré-aquecer a mistura de reação.
8. Adicionar 30 μL da amostra contendo glicogênio sintase em tampão Tris 20 mM, pH 7,8; misturar e transferir a mistura de reação para uma cubeta de metacrilato descartável.
9. Colocar a cubeta no espectrofotómetro e registar a absorbância a 340 nm em intervalos temporizados durante 10 a 20 min. Representar graficamente as absorvâncias obtidas em relação ao tempo.
   nota: Uma reação na qual a amostra de glicogênio sintase é substituída por tampão Tris 20 mM deve ser conduzida para controlar a oxidação não enzimática de NADH. Dependendo da pureza da amostra, outras reações de controle podem ser necessárias.
10. Determine a taxa de reação.

Tabela 1: Soluções de estoque necessárias para o ensaio da atividade da glicogênio sintase.

componente	Direções
50 mM Tris pH 8,0	Dissolver 0,61 g de base Tris em ~ 80 mL de água. Refrigerar a 4 °C. Ajustar o pH para 8,0 com HCl e aumentar o volume até 100 ml com água.
Tampão HEPES de 20 mM	Dissolva 0,477 g de HEPES em ~ 80 mL de água. Ajuste o pH para 7,0 com NaOH e complete o volume para 100 mL com água.
132 mM Tris/32 mM tampão KCl pH 7,8	Dissolva 1,94 g de base Tris e 0,239 g de KCl em ~90 mL de água. Ajustar o pH para 7,8 com HCl e completar o volume para 100 ml com água.
0,8% p/v Glicogénio de ostra	Pese 80 mg de glicogênio de ostra e adicione à água. Faça o volume final de até 10 mL com água e aqueça suavemente/misture para dissolver totalmente o glicogênio.
100 mM UDP-glicose	Dissolver 0,31 g de UDP-glicose em água e fazer o volume final até 1 mL. Conservar em alíquotas, congeladas a -20 °C. Estável durante vários meses.
50 mM ATP	Dissolver 0,414 g de ATP em ~ 13 mL de água. Ajustar o pH para 7,5 com NaOH e completar o volume para 15 ml com água. Conservar em alíquotas congeladas a -20 °C. Estável durante vários meses.
100 mM Glicose-6-fosfato pH 7,8	Dissolver 0,282 g de glicose-6-fosfato em ~ 7 a 8 mL de água. Ajuste o pH para 7,8 com NaOH. Faça o volume até 10 mL com água. Conservar congelado em alíquotas a -20 °C. Estável durante, pelo menos, seis meses.
40 mM Fosfoenolpiruvato	Dissolver 4 mg de fosfoenolpiruvato em 0,5 mL de tampão HEPES 20 mM pH 7,0. Conservar a -20 °C. Estável durante pelo menos 1 semana.
0,5 M MnCl2	Dissolver 9,90 g de MnCl2 num volume final de 100 ml de água.
NDP quinase	Reconstitua o pó liofilizado com água suficiente para dar 1 U/μl de solução. Preparar alíquotas, congelar em azoto líquido e conservar a -80 °C. Estável durante pelo menos 1 ano.

Tabela 2: Mistura de reação de composição para ensaio da atividade da glicogênio sintase.

componente	Volume (μl)
160 mM Tris/32 mM tampão KCl pH 7,8	250
Água	179
100 mM de glicose-6-fosfato, pH 7,8	58
0,8% p/v de glicogénio de ostra	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-glicose	28
40 mM de fosfoenolpiruvato	20
0,5 M MnCl2	8
Volume final	770

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amilopectina (sem amilose) de milho ceroso	Fisher Científico	Rolamento A0456
amilose	Biossintetizador Carbossintético	YA10257
ATP, sal dissódico	MilliporeSigma	A3377
D-glicose-1,6-bifosfato, sal de potássio	MilliporeSigma	G6893
D-glicose-6-fosfato, sal de sódio	MilliporeSigma	G7879
Glicose-6-fosfato desidrogenase, grau I, de levedura	MilliporeSigma	10127655001
Glicogênio tipo II de ostra	MilliporeSigma	G8751
hexoquinase	MilliporeSigma	11426362001
Cuvetes de metacrilato, 1,5 mL	Fisher Científico	Telefone: 14-955-128	O metacrilato é necessário, uma vez que alguns procedimentos são realizados a 340 nm ou menos
Sal de sódio de fosfato de dinucleotídeo de adenina β-nicotinamida	MilliporeSigma	N0505
Dinucleotídeo de adenina β-nicotinamida, sal dissódico reduzido	MilliporeSigma	Rolamento 43420
Nucleosídeo 5'-difosfato quinase	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvato, sal monopotássico	MilliporeSigma	Pág. 7127
Fosfoglucomutase do músculo do coelho	MilliporeSigma	Pág. 3397
Fosforilase A do músculo de coelho	MilliporeSigma	Pág. 1261
Enzimas piruvato quinase / desidrogenase láctica do músculo de coelho	MilliporeSigma	Pág. 0294
UDP-glicose, sal dissódico	MilliporeSigma	U4625