Análise baseada em impedância celular para monitoramento de processos celulares em tempo real

Resumo

Fonte: Labadie, T., et al., Monitorando a sobrevivência do vírus influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, demonstramos o processo de monitoramento em tempo real de eventos celulares, incluindo a proliferação de células aderentes, por meio de um ensaio de impedância celular. Aqui, as células aderentes atuam como isolantes, restringindo o fluxo de corrente entre os eletrodos e aumentando a impedância.

Protocolo

NOTA: Durante todos os experimentos, mantenha as placas em superfícies não eletrostáticas o tempo todo, como os envoltórios de papel da embalagem. Siga a seção 1 abaixo para determinar a concentração mais apropriada de células a serem semeadas na placa de microtitulação eletrônica (projetada como E-Plate).

1. Determinação da quantidade celular apropriada para células infectantes

1. Preparar células MDCK (Madin-Darby Canine Rim) em frascos de 75 cm² para obter células recém-divididas (aproximadamente 80% de confluência) 24 h antes da experiência.
2. Lave as células com 5 mL de 1x PBS e desconecte-as adicionando 3 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25%.
3. Adicione 7 mL de meio de cultura de células frescas e conte as células usando um contador de células automatizado com coloração com azul de tripano.
4. Ajuste a concentração celular para 400.000 células/mL com meio de cultura celular. Realizar diluições seriais duplas em tubos adicionais para obter densidades celulares de 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; e 6.250 células/mL. Ajustar a gama de diluição das células em função do tipo de célula e do seu comportamento de crescimento.
5. Deixe a placa E (Tabela de Materiais) em RT por vários minutos e adicione 100 μL de meio de cultura de células a cada poço usando uma pipeta multicanal. Não toque nos eletrodos da placa E.
6. Destrave os suportes e insira a extremidade frontal da placa no bolso do berço do instrumento de medição de impedância (Tabela de Materiais). Feche a porta da incubadora.
7. Abra o software.
   1. Em "Configuração padrão do padrão do experimento", escolha a(s) base(s) selecionada(s), clique duas vezes na página superior e digite o nome do experimento. Clique em "Layout" e insira as informações de amostra necessárias para cada poço selecionado da placa; em seguida, clique em "Aplicar" quando terminar. Clique em "Agendar" | "Passos" | "Adicionar um passo". O software adiciona automaticamente um passo de 1 s para medir a impedância de fundo (CI).
   2. Clique em "Iniciar/Continuar" na guia "Executar". Clique em "Plotar", adicione todas as amostras selecionando os poços apropriados e certifique-se de que o CI esteja entre -0,1 e 0,1 antes de prosseguir para a próxima etapa.
8. Remova a placa do suporte.
9. Adicione 100 μL de cada suspensão celular da etapa 1.4 em duplicata aos alvéolos apropriados e 100 μL de meio celular nos alvéolos usados como controle. Deixe a placa E na capela de fluxo laminar por 30 min em RT para permitir uma distribuição uniforme das células no fundo dos poços.
10. Insira a placa E no bolso do suporte. Clique em "Agendar" | "Adicionar etapa" no software e insira os valores para monitorar as células a cada 30 minutos por 200 repetições. Em seguida, selecione "Iniciar/Continuar".
11. Verifique e plote os dados do IC clicando no botão "Plotar" no software. Selecione a concentração de células que estão imediatamente antes da fase estacionária 24 h após a semeadura na placa, a fim de obter células que ainda estão em fase de crescimento durante a infecção viral. A fase estacionária é alcançada quando o IC está no máximo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa E 16 (6 placas)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	As placas eletrônicas estão disponíveis em embalagens diferentes
PBS 1X	Tecnologias de vida (gibco)	14040091
TPCK-tripsina	Worthington	LS003740
Instrumento de Análise Celular em Tempo Real xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Os instrumentos xCELLigence RTCA S16 estão disponíveis em diferentes formatos (16 poços, 96 poços, placa simples ou múltipla)
Balão de cultura de tecidos de 75 cm2	falcão	Rolamento 430641U
MEM 1X	Tecnologias de vida (gibco)	31095029