Ensaio celular baseado em impedância para medir a multiplicidade de infecção do vírus influenza

Resumo

Fonte: Labadie, T., et al., Monitorando a sobrevivência do vírus influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, discutimos a correlação entre o CIT₅₀ e a multiplicidade de infecções virais. As células infectadas pelo vírus apresentam efeitos citopáticos, causando sua morte e desprendimento do microeletrodo de ouro, o que, por sua vez, reduz a impedância.

Protocolo

1. Correlação entre os valores do CIT₅₀ e a multiplicidade de infecções

1. Adicione 100 μL de meio de cultura 1x MEM estéril em cada poço da placa E. Insira a placa E no bolso do berço do instrumento a 35°C.
2. Meça o fundo conforme descrito:
3. Abra o software.
   1. Em "Configuração padrão do padrão do experimento", escolha a(s) base(s) selecionada(s) e clique duas vezes na página superior e digite o nome do experimento. Clique em "Layout" e insira as informações de amostra necessárias para cada poço selecionado da placa; em seguida, clique em "Aplicar" quando terminar. Clique em "Agendar" | "Passos" | "Adicionar um passo". O software adiciona automaticamente um passo de 1s para medir a impedância de fundo (CI).
   2. Clique em "Iniciar/Continuar" na guia "Executar". Clique em "Plotar", adicione todas as amostras selecionando os poços apropriados e certifique-se de que o CI esteja entre -0,1 e 0,1 antes de prosseguir para a próxima etapa.
4. Remova a placa E do suporte.
5. Semeie 3 x 10⁴ de células MDCK recém-divididas em cada poço da placa de microtitulação eletrônica e cultive-as por 24h a 35 ° C com 5% de CO₂ para que fiquem em fase replicativa durante a infecção por IAV.
6. Infecte células MDCK com diferentes diluições de 10 vezes de um título conhecido de 6log₁₀TCID₅₀ / mL do vírus H1N1, usando pipetagem reversa para reprodutibilidade seguindo as etapas abaixo:
   1. Enxágue as células MDCK 2x com 100 μL de MEM sem FCS (meio de propagação de vírus). Esteja ciente de remover todos os meios após a segunda lavagem para evitar mais diluição do inóculo.
   2. Adicione 100 μL de suspensão viral em cada poço usando uma pipeta monocanal. Para evitar contaminação, comece da esquerda para a direita e, em seguida, de cima para baixo na placa, cobrindo os poços restantes com a tampa.
   3. Insira a placa no bolso do berço do instrumento a 35°C. Seja gentil para evitar movimentos bruscos que possam levar à contaminação.
   4. Comece a monitorar a impedância da célula a cada 15 minutos durante pelo menos 100 h, conforme descrito:
      1. Insira a placa E no bolso do suporte. Clique em "Agendar" | "Adicionar etapa" no software e insira os valores para monitorar as células a cada 30 minutos por 200 repetições. Em seguida, selecione "Iniciar/Continuar".
   5. Após os dois ciclos de medições (ou seja, 30 min), pause o aparelho clicando em "Pause" na guia "Execute" e remova a placa E do suporte.
   6. Adicione 1μg / mL de TPCK-tripsina ao meio de propagação do vírus para clivar a hemaglutinina viral.
   7. Adicione 100 μL de meio de propagação de vírus contendo TPCK-tripsina em cada poço e insira a placa E na bolsa do berço.
   8. Clique em "Iniciar/Continuar" na aba "Executar"
      nota: Não se esqueça de criar um controle negativo correspondente a células infectadas simuladas, substituindo a suspensão viral por meios de propagação do vírus.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa E 16 (6 placas)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	As placas eletrônicas estão disponíveis em embalagens diferentes
MEM 1X	Tecnologias de vida (gibco)	31095029
TPCK-tripsina	Worthington	LS003740
Instrumento de Análise Celular em Tempo Real xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Os instrumentos xCELLigence RTCA S16 estão disponíveis em diferentes formatos (16 poços, 96 poços, placa simples ou múltipla)