Ensaio de cinética de sobrevivência baseado em impedância celular para avaliar a sobrevivência do vírus

Resumo

Fonte: Labadie, T. et al., Monitorando a sobrevivência do vírus influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve uma técnica baseada em impedância celular para estudar a cinética de sobrevivência de vírus que induzem efeitos citopáticos. O método mede a impedância elétrica de células aderentes infectadas por vírus pré-tratadas com solução salina.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e matérias-primas

1. Preparação de células MDCK e meio de cultura de células estéreis
   1. Cultive células de Rim Canino Madin-Darby (MDCK) em meio de Eagle modificado (MEM) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor (FCS) e antibióticos (100 unidades/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina).
   2. Após o descongelamento, passe as células MDCK pelo menos 2x antes de infectá-las para garantir a recuperação completa (mas menos de 30 passagens para evitar qualquer desvio nos fenótipos celulares).
   3. Semear frasco(s) de cultura de tecidos de 75 cm² contendo 30 ml de 1x MEM estéril com 7,5 x 10⁶ células MDCK e incubar a 37 °C em incubadora humidificada de CO_{5% 2}.
2. Preparação de equipamentos de monitoramento de impedância
   1. Colocar o instrumento na incubadora a 35 °C e deixá-lo aquecer durante pelo menos 2 h.
   2. Conecte-o à unidade de controle colocada fora da incubadora.
   3. Proceda aos procedimentos de limpeza recomendados pelo fabricante antes de iniciar o restante do experimento.
3. Produção de estoques de IAV em células MDCK
   1. Para propagar e amplificar os vírus H1N1, semeie 7,5 x 10⁶ células MDCK em dois frascos de cultura de tecidos^de 75 cm 2 e incube por 24 h a 37 ° C para atingir 90% a 100% de confluência.
   2. Decantar o meio de cultura celular da monocamada de células em balões de 75 cm². Lave as células com 5 mL de PBS 1x estéril.
   3. Remova o PBS e adicione 5 mL de 1x PBS para lavar as células novamente.
   4. Rotular um frasco como controlo e remover o PBS antes de adicionar 15 ml de meios de propagação do vírus (1x MEM com 0% FCS) cuidadosamente na monocamada. Incubar este balão numa incubadora mantida a 35 °C com 5% de CO₂. Use-o para comparação após 3 dias de propagação.
   5. Descongele um frasco para injetáveis de estoque de IAV em RT. Dilua o vírus até a concentração apropriada em um tubo de 1,5 mL contendo meios de propagação do vírus (1x MEM com 0% FCS).
   6. Remova 1x PBS do frasco de 75 cm² e infecte as células MDCK em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 x ^10-3 ou 1 x ^10-4 unidades formadoras de placas por célula (pfu/célula) adicionando 1 mL do vírus diluído à monocamada celular.
   7. Adsorver o vírus nas células MDCK durante 45 min à RT, agitando o balão regularmente de 15 em 15 min.
   8. Remova suavemente o inóculo e adicione 15 mL de meios de propagação do vírus por frasco contendo 1 μg / mL de TPCK-tripsina (tripsina / L-1-tosilamida-2-feniletil clorometilcetona), para clivar a hemaglutinina viral HA0 em subunidades HA1 e HA2 (um evento necessário para a fusão do HA com a membrana endossômica e liberação do genoma viral).
   9. Incubar os frascos a 35 °C e 5% de CO₂ durante, pelo menos, 3 dias para replicar o vírus.
   10. Observe as células MDCK ao microscópio com ampliação de 40x e procure efeitos citopáticos (CPE) nas células (comparando-as com o frasco de controle celular). Se o CPE não estiver completo (ou seja, cerca de 80% das células estão separadas do substrato), coloque os frascos de volta na incubadora por mais 24 horas.
   11. Quando o CPE estiver completo, decantar o sobrenadante da cultura de células e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos para sedimentar os restos celulares.
   12. Transfira o sobrenadante clarificado para um tubo de 15 ml e alíquota dos vírus da progenitura para frascos criogénicos estéreis de utilização única. Coloque imediatamente os tubos criogênicos a -80 °C para congelar e armazenar vírus.
4. Infecte células MDCK com diferentes diluições de 10 vezes de um título conhecido de 6 log₁₀ TCID₅₀ / mL do vírus H1N1, usando pipetagem reversa para reprodutibilidade seguindo as etapas abaixo:
   1. Enxágue as células MDCK 2x com 100 μL de MEM sem FCS (meio de propagação de vírus). Esteja ciente de remover todos os meios após a segunda lavagem para evitar mais diluição do inóculo.
   2. Adicione 100 μL de suspensão viral em cada poço usando uma pipeta monocanal. Para evitar contaminação, proceda começando da esquerda para a direita e depois de cima para baixo na placa, cobrindo os poços restantes com a tampa.
   3. Insira a placa no bolso do suporte do instrumento a 35 °C. Seja gentil para evitar movimentos bruscos que possam levar à contaminação.
   4. Comece a monitorar a impedância da célula a cada 15 minutos durante pelo menos 100 h, conforme descrito na etapa 2.10.
   5. Após os dois ciclos de medições (ou seja, 30 min), pause o aparelho clicando em "Pause" na guia "Execute" e remova a placa E do suporte.
   6. Adicione 1 μg / mL de TPCK-tripsina ao meio de propagação do vírus para clivar a hemaglutinina viral.
   7. Adicione 100 μL de meio de propagação de vírus contendo TPCK-tripsina em cada poço e insira a placa E na bolsa do berço. 8. Clique em "Iniciar/Continuar" na aba "Executar"
      nota: Não se esqueça de criar um controle negativo correspondente a células infectadas simuladas, substituindo a suspensão viral por meios de propagação do vírus.

2. Cinética de sobrevivência do IAV

1. Exponha o IAV à água destilada salina a 35 °C e teste sua infectividade ao longo do tempo medindo a diminuição da impedância celular.
   1. Prepare água destilada salina adicionando NaCl a uma concentração final de 35 g/L em água destilada. Adicione 900 μL de água salina em 2 mL de criotubos.
   2. Adicione 100 μL de estoque viral em água salina e coloque os criotubos em uma incubadora (35 °C, 5% CO₂) por 1 h, 24 h ou 48 h.
   3. Semear 100 μL (contendo 3 x 10,4) de células MDCK recém-divididas em uma placa de microtitulação de 16 poços e crescer por 24 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
   4. Infectar células com 100 μL de vírus expostos (previamente diluídos 10x em meios de cultura) usando o método de pipetagem reversa para reprodutibilidade, repetindo a seção 1.4.
2. Monitore a impedância da célula a cada 15 minutos por pelo menos 100 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina	ThermoFisher	25200056
Balão de cultura de tecidos de 75 cm2	falcão	Rolamento 430641U
Placa E 16 (6 placas)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	As placas eletrônicas estão disponíveis em embalagens diferentes
Fcs	Tecnologias de vida (gibco)	10270-106
MEM 1X	Tecnologias de vida (gibco)	31095029
PBS 1X	Tecnologias de vida (gibco)	14040091
Penicilina-estreptomicina	Tecnologias de vida (gibco)	11548876
TPCK-tripsina	Worthington	LS003740
Instrumento de Análise Celular em Tempo Real xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Os instrumentos xCELLigence RTCA S16 estão disponíveis em diferentes formatos (16 poços, 96 poços, placa simples ou múltipla