Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

Resumo

Fonte: Borges, C. R. et al., Avaliação do Estresse Oxidativo em Amostras Biológicas Utilizando o Ensaio de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico. J. Vis. (2020)

Este vídeo demonstra o ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local

1. Ensaio TBARS

NOTA: Uma vez iniciado o ensaio TBARS, ele deve ser concluído sem parar.

1. Colher o máximo de amostras e padrões centrifugados a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, mantenha os tubos de vidro contendo as amostras e os padrões em RT. tubos de vidro conforme necessário para o número de amostras a serem analisadas e rotule-os com os nomes das amostras. Em seguida, adicione 100 μL de cada amostra preparada (lisados de células HepG2, lipoproteínas de baixa densidade, soro humano) a cada tubo de vidro.
2. Adicione 200 μL de SDS a 8,1% a cada amostra e padrão e gire suavemente o tubo de vidro em movimentos circulares para misturar a amostra.
3. Adicione 1,5 mL do tampão acetato de sódio 3,5 M (pH = 4) a cada amostra e padrão.
4. Adicione 1,5 mL do tampão acetato de sódio 3,5 M (pH = 4) a cada amostra e padrão.
5. Traga o volume final para 4 mL para cada amostra e padrão adicionando 700 μL de água DI.
6. Tampe bem cada tubo de vidro e incube em um bloco de aquecimento ajustado a 95 ° C por 1 h. Cubra os tubos de vidro com papel alumínio para evitar condensação na parte superior dos tubos.
7. Remova os tubos de vidro do bloco de aquecimento e incube no gelo por 30 min.
8. Centrifugue amostras e padrões a 1500 x g por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, manter os tubos de vidro contendo as amostras e padrões em RT.
   nota: Manter as amostras no gelo ou a 4 °C fará com que toda a amostra ou padrão precipite.
9. Imediatamente após a centrifugação, alíquota de 150 μL de sobrenadante de cada tubo e colocá-lo em um poço separado de uma placa de 96 poços.
10. Remova as bolhas de cada poço usando uma ponta de pipeta.
    nota: A presença de bolhas produzirá leituras de absorbância inconsistentes, levando a uma alta imprecisão do ensaio.
11. Ler absorbâncias a 532 nm. Subtraia a leitura média de absorbância das amostras em branco de todas as outras leituras de absorbância.
12. Crie uma curva padrão plotando as leituras de absorbância subtraídas em branco a 532 nm versus a concentração conhecida de cada padrão. Ajuste os pontos de dados usando regressão linear. Calcule as concentrações de amostra desconhecidas usando a equação da linha de regressão linear obtida da curva padrão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS estéril pH 7,4 1 L	VWR, PA	101642--262	Reagente de lise celular
Tubo de centrífuga autônomo de 50 mL	Corning, Nova Iorque	CLS430897	Material geral
Placa de 96 poços, não tratada, transparente, com tampa, não estéril	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Para medir a absorbância
Dispositivo de filtro de rotação centrífuga Amicon Ultra-0.5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Purificação de LDL
Tampas para tubos de vidro	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	Para ensaio TBARS
Cloreto de cobre II	SIGMA, MO	222011-250G	Para induzir a oxidação
Tubos de cultura, descartáveis, com acabamento com tampa de rosca, vidro borossilicato (13 x 100 mm)	VWR, PA	Rolamento 53283-800	Para ensaio TBARS
Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	Meios de célula HepG2
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Material geral
Eppendorf Tubos Safe-Lock, 2,0 mL	Genesee Sceitific, Califórnia	22363352	Material geral
Soro fetal bovino fonte dos EUA	Omega Scientific, CA	FB-11	Para cultura de células
Ácido Acético Glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	Reagente TBARS
Coquetel Inibidor de Protease Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	Rolamento 87786	Reagente de lise celular
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	Solvente LDL
Ácido clorídrico (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	Reagente de lise celular
Centrífuga Legend Micro 17	Thermo Scientific, MA	75002431	Material geral
Lipoproteína de Baixa Densidade Plasmática Humana	Atenas Pesquisa e Tecnologia, GA	16/12/120412	Protótipo de matriz biológica
Barras de agitação magnéticas, Octógono 6-Sortimento	VWR, PA	Rolamento 58948-025	Material geral
Malondialdeído bis (dimetilacetal)	SIGMA, MO	8207560250	Padrão TBARS
Espectrofotômetro de microplacas Multiskan Go	Fisher Scientific, NH	51119200	Para medir a absorbância
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	Rolamento 492016-100ML	Reagente de lise celular
cloreto de sódio	SIGMA, MO	S7653-1KG	Reagente de lise celular
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	SIGMA, MO	Rolamento 436143-100G	Reagente TBARS
hidróxido de sódio	SIGMA, MO	367176-2.5KG	Reagente TBARS
Concentrador SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Para concentrar lisados celulares
Ácido tiobarbitúrico	SIGMA, MO	T5500-100G	Reagente TBARS
Base TRIS	Fluka, Geórgia	Rolamento 93362	Reagente de lise celular