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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação
- Adicione 5 mL de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mL de meio clássico completo com soro. Alíquota de 50 mL do meio inicialmente.
nota: Não devolva nenhum meio ao estoque para evitar contaminação.
- Coloque uma alíquota do meio clássico completo no gelo.
- Use etanol a 70% para limpar o microscópio de dissecação, fórceps e tesoura.
- Prepare duas placas de cultura de células (10 cm), uma no microscópio de dissecção e outra no gelo; coloque 10 mL de meio clássico completo em cada prato.
2. Etapas experimentais (Figura 1)
- Sacrifique camundongos C57BL/6J em torno do pós-natal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de cetamina e 7,5 -10 mg/kg de xilazina injetados por via intraperitoneal. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação.
- Remova o tecido conjuntivo (músculo e tecido adiposo) e o nervo óptico do olho.
- Use uma microtesoura para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior ao limbo da córnea. Remova o complexo córnea/íris, vítreo e o cristalino.
- Faça uma incisão de 1 mm perpendicular à borda cortada em direção ao nervo óptico e corte uma faixa circunferencial de 1 mm de largura. Separe as regiões central e periférica do complexo. Use uma pinça para retirar a retina do complexo EPR/coroide/esclera.
- Mantenha a banda coróide periférica em meio clássico completo no gelo; isole o outro olho e repita o processo para cortar uma segunda faixa.
- Corte a faixa circular em 6 ~ pedaços quadrados iguais (~ 1 mm x 1 mm).
nota: Nunca toque em nenhuma borda.
- Descongele o extrato de membrana basal (BME) de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 30 μL/alvéolo de BME no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forme uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas.
nota: Descongele o BME durante a noite na geladeira. O BME deve estar no gelo a qualquer momento após o descongelamento.
- Coloque o tecido no meio do BME.
nota: Não alise o explante coróide; geralmente, deixe o tecido se expandir dentro do BME. A orientação do tecido (lado escleral para cima ou para baixo) não afeta o resultado experimental.
- Incubar a placa a 37 °C durante 10 min para que o gel se solidifique.
- Adicione 500 μL do meio/poço clássico completo.
- Troque o meio clássico a cada dois dias (500 μL). A brotação da coroide pode ser observada após 3 dias com microscópio.
nota: Para o tratamento com fator de crescimento, deixe o tecido passar fome por 4 h. Dilua um composto experimental em um meio com fator de crescimento reduzido (aumento de 1:200 em vez de 1:50).
3. Método de quantificação computadorizada SWIFT-Choroid (Figura 2)
NOTA: Foi utilizado um método computadorizado para medir a área coberta por vasos em crescimento. Um plug-in de macro para o software ImageJ é necessário antes da quantificação.
- Abra a imagem de brotamento de coróide com ImageJ e marque "Imagem |Tipo| 8 bits" com escala de cinza.
- Vá para "Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste (Ctrl/shift/C)" e otimizar o contraste.
- Use a função varinha mágica para delinear e remover da imagem o tecido coróide que está presente no centro dos brotos (usando a tecla de atalho "F1") (Figura 2A, B).
nota: Defina a taxa de tolerância da varinha mágica para 20-30%.
- Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção livre (Figura 2C). Vá para "Imagem | Ajustar | Limite (Ctrl/shift/T)". Use a função de limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo e a periferia (Figura 2D).
- Clique em "F2" e um resumo aparecerá. Salve uma imagem da área selecionada clicando em "Salvar". Salve-o na mesma pasta da imagem original para referência futura.
- Após a medição de um grupo de amostras, copie o registro para análise dos dados.
nota: Também é possível medir a área (μm²) por "Analisar | Definir escala" usando imagens com barras de escala.
